[发明专利]利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑

权利要求书

1.一种组合物，所述组合物包含如下载体，所述载体编码包含至少一种核酸内切酶和DNA结合部分的融合蛋白。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述融合蛋白包含至少一种选自由以下组成的群组的核酸内切酶：cas规则间隔的短回文(CRISPR)蛋白、锌指核酸酶(ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述CRISPR蛋白包含cas9。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述DNA结合部分包含锌指蛋白。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述锌指包含左旋CCR5结合蛋白。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种核酸内切酶和DNA结合部分由包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连接子接合。

7.如权利要求1所述的组合物，其中所述融合蛋白包含荧光标记蛋白。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述荧光标记蛋白包含一种或多种选自由以下组成的群组的蛋白质：绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、红色荧光蛋白(RFP)和mCherry。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述融合蛋白包含核定位信号(NLS)。

10.如权利要求9所述的组合物，其中所述NLS是SV40NLS。

11.一种基因组编辑方法，所述方法包括：

(a)提供一定量的一种或多种载体，所述载体编码包含至少一种核酸内切酶和DNA结合部分的融合蛋白；以及

(b)使细胞群体与所述量的所述一种或多种载体接触，其中所述融合蛋白能够诱发双链断裂(DSB)并且所述DSB的同源重组(HR)引起所述细胞群体的基因组的编辑。

12.如权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(b)中使所述细胞群体与一种或多种指导RNA(gRNA)接触。

13.如权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括在步骤(b)中使所述细胞群体与模板DNA接触。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述模板DNA包含至少一个表达盒、两个侧翼序列和DNA结合部分序列。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述两个侧翼序列每个至少10bp，并与所述细胞群体的基因组中的序列同源。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述DNA结合部分序列包含CCR5。

17.如权利要求11所述的方法，其中接触所述细胞群体包含选自由以下组成的群组的技术：转染、电穿孔和转化。

18.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞群体包含干细胞或祖细胞。

19.一种用于基因组编辑的试剂盒，所述试剂盒包含：

一种或多种载体，所述载体编码包含至少一种核酸内切酶和DNA结合部分的融合蛋白；以及

模板DNA，所述模板DNA包含至少一个表达盒、两个侧翼序列和DNA结合部分序列。

20.如权利要求19所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种或多种指导RNA(gRNA)。

21.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述融合蛋白包含至少一种核酸内切酶CRISPR蛋白、DNA结合部分锌指蛋白。

22.如权利要求21所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含荧光标记蛋白。

23.如权利要求21所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含核定位信号(NLS)。