[发明专利]利用重组核酸内切酶系统的最佳化基因编辑

说明书

发明领域

本文描述了用于遗传序列的体外和体内操控以进行研究和治疗活动，包括产生敲除和敲入序列以进行基因组编辑的方法和组合物。

发明背景

在过去的10年间，CRISPR-Cas基因组编辑已经成为一项更加成熟的技术。像所有其它的基因组编辑技术一样，它能够产生敲除表型，但是在引入供体DNA序列的敲入方面不是非常有效。对生物技术和初级研究更有用的酶的研发包括提高酶的功效，创造新的酶来满足需求，或修改酶以扩大其功能性。举例来说，克列诺(Klenow)核酸外切酶-酶是克列诺大片段的截短形式。此经修饰的DNA聚合酶保持其聚合酶活性，但失去了大片段回嚼(chew back)3’DNA悬垂物的能力。另一个实例包括DNA聚合酶，DNA聚合酶是一种有专利权的融合蛋白，它由校对DNA聚合酶加赋予较高拷贝速率的另一DNA聚合酶的结构域组成。将这些原理扩大至基因组编辑领域，将能够创造一种新的Cas-9蛋白，所述蛋白保持现存的DNA核酸内切酶活性，同时提高了供体DNA序列整合至基因组的效率。提出了若干策略来解决此需求。

尤其在供体DNA插入基因组方面存在若干障碍。非同源末端接合(Non-homologous end joining，NHEJ)虽然是一种适于敲除基因的方法，但它总体上无法在不存在任何其它突变下来整合供体DNA。同源性指导修复(Homology directed repair，HDR)涵盖至少两种形式：需要霍利迪结构(Holliday structure)来解决整合的长序列同源性臂，或依赖于链侵入和紧急DNA修复系统来解决整合事件的短同源性臂。HDR与NHEJ的任何组合将主要在NHEJ解决的受损DNA部分内产生indel(插入和缺失)突变。本质上，随机过程决定了同源DNA可能的整合，并且困扰敲入的有效基因组编辑，包括供体DNA片段的长度与整合效率之间的反比关系，供体DNA的整合效率与细胞中的供体DNA浓度和线性DNA片段的细胞毒性过多成正比，以及双链断裂的两个自由端的空间限制，因此引起的最可能结果是两个末端再次退火。

本文描述了如下重组融合蛋白的研发，所述重组融合蛋白主动在较接近基因组裂解位点处募集线性DNA插入物，从而提高整合效率，尤其是大DNA片段整合至基因组的效率。此类对基因组编辑技术的改良允许在不牺牲效率下使用较低的线性DNA浓度，并且可以进一步与例如荧光蛋白报告系统等其它特征组合。

发明概要

本文描述了一种组合物，所述组合物包括如下载体，所述载体编码包括至少一种核酸内切酶和DNA结合部分的融合蛋白。在多个实施方案中，融合蛋白包括至少一种选自由以下组成的群组的核酸内切酶：cas规则间隔的短回文(cas regularly interspaced short palindromic，CRISPR)蛋白、锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)。在多个实施方案中，CRISPR蛋白包括cas9。在多个实施方案中，DNA结合部分包括锌指蛋白。在多个实施方案中，锌指包括左旋CCR5结合蛋白。在多个实施方案中，至少一种核酸内切酶和DNA结合部分由包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸的连接子接合。在多个实施方案中，融合蛋白包括荧光标记蛋白。在多个实施方案中，荧光标记蛋白包括一种或多种选自由以下组成的群组的蛋白质：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)和mCherry。在多个实施方案中，融合蛋白包括核定位信号(nuclear localization signal，NLS)。在多个实施方案中，NLS是SV40NLS。