[发明专利]簇中的表面引物的增强利用

权利要求书

1.一种制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法，所述方法包括：

(a)提供具有固定在其上的多个正向和反向扩增引物的固体支持物，其中所述多个扩增引物的子集包含裂解位点；

(b)使用在所述支持物上所述扩增引物的子集扩增靶核酸模板以产生多个双链核酸分子，其中每个双链核酸分子的两条链在其5’末端附接至所述固体支持物；

(c)在所述裂解位点裂解所述扩增引物的子集以产生线性化扩增产物，所述线性化扩增产物包含裂解的非固定化链和互补的固定化链；以及

(d)将所述扩增产物置于部分变性条件下以促进所述裂解的非固定化链的3’末端部分与互补的固定化扩增引物杂交，随后将所述固定化的扩增引物延伸，以产生所述扩增产物的非固定化链的固定化副本。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中裂解的所述扩增引物的子集是正向引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)中裂解的所述扩增引物的子集是反向引物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述部分变性条件包括加入重组酶/聚合酶扩增反应的一个或多个组分以促进链侵入。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述部分变性条件包括将所述模板置于适于模板步移的条件下。

6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括应用在溶液中的引物以促进所述引物与所述固定化扩增产物的非固定化末端杂交。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述引物的子集包含正向扩增引物，并且所述在溶液中的引物含有正向扩增引物。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述引物的子集包含反向扩增引物并且所述在溶液中的引物含有反向扩增引物。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，还包括对靶核酸测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其中对所述靶核酸测序包括：

将一个或多个测序引物与固定化核酸链杂交；

通过将一个或多个标记核苷酸掺入新生链延伸所述一个或多个测序引物；以及

检测所述标记核苷酸，从而获得关于所述靶核酸的序列信息。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述固体支持物是平面的。

12.根据权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中所述固体支持物包括微孔。

13.根据权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中所述靶核酸具有至少10、20、50、100、200个或至少500个核苷酸的长度。