[发明专利]簇中的表面引物的增强利用

说明书

本申请提供了用于在表面扩增过程中增强表面引物利用的方法和组合物。这些方法对于提高密度的表面扩增是有用的。本申请提供的方法和组合物能够在与目前使用标准簇扩增可以达到的相同密度下产生更加明亮的簇。

背景技术

将人类遗传变异进行编目并将这种变异与疾病易感性相关联的工作是艰巨且昂贵的。使该成本显著降低对于促进对健康和疾病的理解是必不可少的。降低测序成本需要在该领域出现很多技术进步。能够降低基因组分析成本的技术进步包括：(1)产生文库；(2)高度并行的克隆扩增和分析；(3)发展耐用的循环测序生化方法；(4)发展超快成像技术；以及(5)发展用于由短读取进行序列组装的算法。

以高度并行方式产生克隆扩增对于节约成本的测序是重要的。测序通常是在传统上由从挑取单个细菌集落生长的质粒制备的DNA分子的克隆群体上进行的。在人类基因组计划中，单独挑取每个克隆、使其生长以及从克隆中提取和扩增DNA。近年来，已经涌现出一些创新使得能够对DNA克隆进行高度并行的分析，特别是基于阵列的方法。在最简单的方法中，可以在其本质上是克隆的单分子水平对文库进行分析。单分子测序的主要优点是循环测序可以异步进行，因为每个分子都是单独读取的。相比之下，克隆扩增分析需要每个测序循环均接近定量完成，否则随着每个随后循环的进行背景噪音持续增加，这严重限制了读取长度。因此，克隆分析对测序生化方法的耐用性造成了更大负担并且可能潜在限制了读取长度。

因而，存在开发方法以改进基因组分析以及提供用于序列分析的更加节约成本的方法的需求。本发明满足了这种需求并且还提供了相关优点。

发明概述

本申请提供了在提高的密度下能够表面扩增的方法和组合物。本申请描述了用于在表面扩增过程中增强表面引物利用的方法。该方法对于在提高的密度下的表面扩增是有用的。本申请提供的方法和组合物能够在与目前使用标准簇扩增可以达到的相同密度下产生更加明亮的簇。更加明亮的簇可以具有多种优点例如，更好的读取质量、支持更长的读取长度、更快的测序扫描时间以及增加的系统耐用性。

本申请提供了用于制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法和组合物，包括：(a)提供具有固定在其上的多个正向和反向扩增引物的固体支持物，其中多个扩增引物的一个子集包含裂解位点；(b)使用在支持物上引物的子集扩增模板以产生多个双链核酸分子，其中每个双链核酸分子的两条链在其5’末端附接至固体支持物；(c)在裂解位点裂解引物的子集；以及(d)将裂解的链置于部分变性条件下以促进扩增产物非固定化链的一部分与互补的固定化扩增引物杂交，随后将固定化的扩增引物延伸，以产生扩增产物非固定化链的副本。

在一些实施方式中，部分变性条件包括加入重组酶/聚合酶扩增反应的一个或多个组分以促进链侵入。在一些实施方式中，部分变性条件包括将模板置于适于模板步移(template walking)的条件下。

在一些实施方式中，步骤(d)包括应用在溶液中的引物以促进引物与固定化扩增产物的非固定化末端杂交。

在下述的附图和说明书中描述了一个或更多个实施方式的细节。其他特征、目标和优点将是从说明书和附图以及从权利要求中显而易见的。

附图说明

图1是显示根据一个实施方式的扩增方法的示意图。

图2是显示根据一个实施方式的扩增方法的示意图。

图3显示了根据不同方法扩增的SyBr Green染色簇的比较结果。

图4显示了根据不同方法扩增的簇的比较结果。上面的图显示了在第一轮核苷酸掺入后的成像扫描。下面的图显示了在各道中簇的Cy3和Cy5染色结果。

图5是显示用于产生配对端匝(end turn)的替代方法的示意图。

图6是显示在图5中所示方法的附加步骤的示意图。

发明详述