[发明专利]基于乙型肝炎核心抗原的疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及包含具有连接至e1环的糖的乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白、生产连接有糖的蛋白的方法、含有所述蛋白的药物组合物和所述蛋白在对象中诱导免疫响应的用途。

背景技术

乙型肝炎（Hepatitis B）病毒核心（HBc）蛋白具有某种程度上的独特结构，它由两个反平行的α螺旋组成，其形成特有的“穗（spike）”结构。然后两个HBc分子自发地二聚化形成双穗束。该双穗束是病毒样颗粒（VLP）的构成部件。VLP是具有吸引力的疫苗系统，因为它们的高度重复序列递送抗原的多个拷贝。进一步地，病毒核酸的缺乏使得它们成为特别安全的载体。HBc作为疫苗载体是特别有趣的，因为它具有几个可能让抗原序列插入的位点。然后HBc的极端免疫原性也赋予被插入的序列，因此使得其也具有过度的免疫原性。最佳的插入位点是主要插入区域（MIR）。然而，先前表明，当较大的或疏水性的序列被插入MIR时，则单体的HBc不能二聚化且VLP没有形成。这导致免疫原性的大量损失。

目前没有可用于细菌生物威胁因子类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）和鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）的许可疫苗，它们分别为类鼻疽和鼻疽的致病因子。

发明内容

本发明涉及一种基于乙型肝炎（HBV）核心蛋白的疫苗递送系统。在递送之前，糖被连接至HBV核心蛋白，使得能够引起对糖类的免疫响应。

因此本发明提供一种包含乙型肝炎核心抗原（HBcAg）的蛋白，其具有在el环中的式X_pZ_qX_r的序列，其中X是带负电荷的氨基酸残基，Z是带正电荷的氨基酸残基，并且p、q和r每个都独立地为1至12的整数，并且其中糖被连接至Z残基。所述蛋白可以包含串联的HBcAg的第一拷贝和第二拷贝，其中HBcAg的一个或两个拷贝具有被连接至e1环的糖。

本发明还提供：

- 一种包含本发明的蛋白的多个拷贝的颗粒；

- 一种生产本发明的蛋白的方法，所述方法包括将一个或多个糖连接至e1环；

- 一种药物组合物，其包含本发明的蛋白或本发明的颗粒以及药学上可接受的载体或稀释剂；

- 用于在人体或动物体的疫苗接种方法中使用的本发明的蛋白或本发明的颗粒；

- 本发明的蛋白或本发明的颗粒用于制备用于人体或动物体的疫苗接种的药物的应用；以及

- 一种在对象中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述对象施用本发明的蛋白或本发明的颗粒。

附图说明

图1：SDS-PAGE证实了串联核心在酵母裂解物的可溶性级分中被发现。提取粗裂解物（泳道3），在20,000xg下旋降（spun），提取上清液（泳道4）。颗粒（泳道5）中的任何物质都不可用。上清液被稀释（泳道6），然后通过0.8 µm、0.45 µm和0.2 µm的三个过滤器（泳道7-9）。材料通过横流过滤器并保留滞留物（泳道10）。将其过滤，然后置于CL4B柱（泳道11）上。然后将空隙体积通过S1000柱（12泳道）。

图2：从CL4B柱的空隙体积中分离VLP（（B）的左侧面板上的较大的峰）。泳道上方的数字是从CL4B柱收集的级分编号。

图3：然后将CL4B空隙通过S1000柱，从级分12-15分离VLP。通过SDS-PAGE和免疫印迹（western blot）确认纯度。数字是从第二S1000柱收集的串联核心阳性级分。

图4：（A）使用银染色的SDS-PAGE证实，存在串联核心（标有*），但纯度低于同等的酵母制剂。（B）电子显微镜将主要污染物识别为杆状病毒病毒粒子本身。

图5：泳道A：分子量标记物，泳道B：未修饰的VLP，泳道C：经修饰的VLP。

图6：（A）蔗糖垫的示意图（未按比例）、（B）未结合的FITC和（C）FITC-VLP结合物。

图7：泳道A：分子量标记物，泳道B：BSA（2 mg/ml），泳道C：BSA（0.5 mg/ml），泳道D：糖结合物（2 mg/ml）和泳道E：糖结合物（0.5 mg/ml）。

图8：携带LolC插入物的VLP在ELISA中被测试，其使用感染了野生型伯克霍尔德氏菌的小鼠中产生的抗体。对应于VLP LolC的线对30 ug/ml的值位于1.6和1.8平均OD之间。对应于空载VLP的线对30 ug/ml的值位于0.4平均OD附近。