[发明专利]用于选择具有脂肪酶活性的酶的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年4月7日提交的美国临时申请号62/144,001的优先权权益，该美国临时申请的内容通过引用完全结合在此。

序列表的引用

本申请包括处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

技术领域

本发明属于蛋白质工程设计和选择的技术领域。更具体地，本发明涉及借助于定向进化的酶增强。

背景技术

脂肪酶用于各种工业应用，尤其包括用于改进的污渍去除的洗涤剂组合物中的家庭护理，以及作为生面团稳定乳化剂的烘焙。虽然脂肪酶已被成功地修饰以改进所希望的性质(参见例如WO 2003/060112、WO 2008/079685、和WO 2013/149858)，脂肪酶变体的开发典型地包括蛋白质工程技术，例如合理设计和/或定向进化，然后进行费力的酶法测定以测试改进的功能。因此，强烈需要快速有效地鉴定编码具有改进的脂肪酶活性的多肽的那些合成基因的方法。

发明内容

在此描述的是用于改进脂肪酶活性的系统及其组分。因此，在一个方面中，是选择具有脂肪酶活性的多肽的方法，该方法包括：

(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：

(a)编码多肽的多核苷酸，以及

(b)与所述多核苷酸连接的脂肪酶底物；并且

其中该水相包括用于表达该多肽的组分；

(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；

(iii)在该乳剂的水性液滴内表达该多肽，其中在水性液滴中具有脂肪酶活性的多肽水解该液滴中的一个或多个合成化合物；以及

(iv)分离这些合成化合物以回收水解的和/或非水解的合成化合物。

在另一个方面中，是合成化合物，该合成化合物包括：(a)编码多肽的多核苷酸，以及(b)与所述多核苷酸连接的脂肪酶底物。

在另一个方面中，是制备该合成的化合物的方法，该方法包括：(i)将脂肪酶底物与编码多肽的多核苷酸连接，并且(ii)回收该合成化合物。

在另一个方面中，是包含复数个合成化合物的多核苷酸文库。

在另一个方面中，是包含该多核苷酸文库的油包水乳剂，其中该文库的合成化合物在乳剂的水性液滴中被区室化。

在另一个方面中，是制备该乳剂的方法，该方法包括：(i)将该复数个合成化合物悬浮在该水相中，并且(ii)将(i)的悬浮液与油混合。

附图说明

图1示出了涉及根据本发明的阴性选择方法的脂肪酶选择的方法步骤的示例性图示。

图2示出了野生型疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的DNA编码序列(SEQ ID NO:2)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。SEQ ID NO:1(未示出)还包含用于体外转录/翻译和PCR扩增的5'和3'核苷酸(参见实例)。

图3示出了催化无活性的疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的DNA编码序列(SEQ ID NO:5)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。SEQ ID NO:4(未示出)还包含用于体外转录/翻译和PCR扩增的5'和3'核苷酸(参见实例)。

图4示出了通过使用本发明的系统，与催化无活性的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶相比野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的自富集的图示。

图5示出了涉及根据本发明的阳性选择方法的脂肪酶选择的方法步骤的示例性图示。

图6示出了通过使用本发明的阳性选择系统，合成化合物在用野生型疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶水解后富集的图示。

定义

烷基：除非另有说明，否则术语“烷基”意指直链(即未分支的)碳链或支链碳链或其组合，“烷基”可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以任选地被一个或多个单、二、或多价基团取代。