[发明专利]用于筛选气味剂和芳香受体的细胞系

说明书

技术领域

本技术领域涉及气味剂和芳香受体，以及可用于鉴定气味剂和/或芳香化合物或这种调节剂的测定法。该测定法更具体地针对显示出改善的气味剂受体活性的工程化细胞系。

背景技术

通过挥发性调味与香味化合物和驻留在嗅觉上皮组织的嗅觉受体神经元的膜上的气味剂受体(OR)蛋白质之间的相互作用，气味最初被编码在外周嗅觉系统(即鼻子)中。这样的相互作用以气味特异性组合方式发生，其中任何单个OR可以被多种气味剂激活，并且相反地，大多数气味剂能够激活若干不同的OR。对于给定的气味剂/芳香化合物或混合物，这些受体相互作用在大脑中产生神经生理学信号并最终产生有意识的气味感知。人类基因组中约400个OR基因可被数千或更多的气味刺激物激活，这是气味剂与受体之间的组合相互作用的固有复杂性，其允许我们可以感知的嗅觉的广度。阐明这些相互作用可以导致发现有益的产品，包括但不限于阻断不适气味感知的恶臭抵消剂，替代不可生物降解或有毒化合物的新的调味和香味成分，以及限制我们难以从天然来源追溯化合物的依赖性的气味增强剂。

需要例如但不限于可以在细胞表面上功能性地表达OR以便OR编码的可靠解码的新方法。还需要一种方法，其在非嗅觉细胞(例如但不限于异源细胞系)中功能性地表达OR，这些非嗅觉细胞经得起用挥发性调味和香味化合物文库进行高通量筛选而用于OR活性的全面表征。这可以显著加速发现非常理想的恶臭抵消剂、气味调节剂和新的调味或香味化合物。

源自嗅觉感觉神经元的某些蛋白质可以改善非嗅觉细胞系中气味剂受体的细胞表面定位。这些蛋白质通过协助将气味剂受体从内质网运输到细胞的高尔基体和质膜而起作用。据报道，受体转运蛋白1(RTP1)、受体转运蛋白2(RTP2)和受体表达增强蛋白1(REEP1)改善气味剂受体质膜定位并因此在非嗅觉细胞中起作用。据报道，RTP1是最有效的气味剂受体伴侣蛋白。已经证明这种蛋白质部分地通过与内质网中的气味剂受体相互作用而起作用。因此，经得起高通量筛选且含有RTP1基因的非嗅觉细胞系非常理想地用于全面解码气味剂与气味剂受体之间的组合相互作用。

更期望的是这样一种细胞系，其通过稳定地表达来自内源性RTP1基因座的基因，连续地产生RTP1蛋白(包括但不限于RTP1S)。然而，开发稳定表达内源性RTP1基因的细胞系的现有技术涉及将DNA插入到培养细胞中的低效且麻烦的分子生物学方法，如若不然该培养细胞不表达该基因。因此，希望使用这样一种技术，其避免这种方法来开发稳定的细胞系并且允许内源性RTP1的连续表达而不需要使用重组方法。

CRISPR/Cas9是一种高效的基因组编辑工具，用于生成精确的基因组修饰，例如插入和缺失。例如，CRISPR/Cas9的一种特定用途使得能够表达基因，如若不然该基因在细胞系中会沉默。通过在基因的上游整合转录启动子，细胞系可以表达内源性基因，如若不然该内源性基因是非活性的。

发明内容

一种细胞，在该细胞内包含激活的内源性RTP1基因，其中该细胞还表达RTP1蛋白。

本文提供了具有改善的气味剂受体功能的非嗅觉细胞系，其包含激活的内源性RTP1基因。

本文提供了一种非嗅觉细胞系，在该细胞内包含激活的内源性RTP1基因，其还表达RTP1蛋白。

本文还提供了一种在真核细胞中激活内源性RTP1基因的方法，包括：

a.引入与RTP1基因上游的基因组靶位点互补的向导RNA；

b.引入Cas核酸酶蛋白以与向导RNA形成复合物；和

c.使用向导RNA/Cas9基因组靶向复合物来特异性递送RTP1基因的基因激活元件。

本文还提供了一种鉴定化合物的方法，该化合物激活、模拟、阻断、抑制、调节和/或增强嗅觉受体在非嗅觉细胞中的活性，其中该细胞包含激活的内源性RTP1基因，其中该方法还包括：

a.使该受体或其嵌合体或片段与激活、模拟、阻断、抑制、调节和/或增强该受体的化合物接触；和

b.确定该化合物是否对该受体的活性有影响。

附图说明

图1显示了内源性RTP1基因座和用于基因组编辑的特定靶位点的示意图。

图2显示了CMV启动子插入过程的示意图。

图3显示野生型和重组等位基因以及相应的基因型区域的示意图。

图4显示了工程化细胞系中CMV启动子整合的表征。