[发明专利]用于改进巴豆醇生产的工程化微生物和方法

说明书

优先权要求

本申请要求2015年4月9日提交的序列号62/145,290的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

同时，亦以引用的方式将2016年3月29日创建的标题为“GNO0025WO序列ST25”、大小为31kb的ASCII文本文件的全部内容并入本申请。

背景技术

巴豆醇(Crotylalcohol)，也称为巴豆醇(crotonylalcohol)或2-丁烯-1-醇(but-2-en-l-ol)，是图1所示化学式C₄H₈O的不饱和醇。巴豆醇是一种有价值的化学中间体，用作烯烃的前体，包括1,3-丁二烯，巴豆酰卤，酯和醚，，而后者是聚合物、精细化学品、农药和药物生产中的化学中间体。

生产改进巴豆醇的工程化微生物是基于石油生产的具吸引力的替代物。但是当这些醇由细胞产生并释放时，它们会在培养过程中在培养基中累积。由于微生物，如细菌，通常具有低的醇耐受性，培养基条件的改变可影响微生物的生长和生存。

培养期间从培养基中移除酒精是解决这一问题的一种方法。但是这种移除过程可能是昂贵和低效的。另一种方法是使用对醇具有更高耐受性的天然细菌分离物。然而，这种菌株通常不适用于工业生产或工程。

发明内容

公开了用于生产作为生物产品或作为其他生物产品的中间体的巴豆醇的方法和工程化微生物。

在一个实施例中，提供了使用工程化微生物生产生物产品的方法，其中，巴豆醇是生物产品，或者巴豆醇是生物产品途径中的中间体(例如1,3-丁二烯，1,3-丁二醇，甲基乙烯基甲醇)，该方法包括：

在生产巴豆醇的条件下，或生产生物产品时使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体的条件下，培养工程化微生物，其中，工程化微生物包括至少一种基因修饰，该基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH，或(c)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶或(a)，(b)和(c)的任何组合的活性的部分或完全丧失。

在一些实施例中，微生物还包含至少一种编码生物产品途径的酶的外源核酸，其中生物产品途径是巴豆醇途径，或者使用巴豆醇作为生物产品的途径的中间体。

在另一个实施例中，公开了一种工程化微生物，包括至少一种基因修饰，所述基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH(C)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶或(a)、(b)和(c)的任何组合的活性的部分或完全丧失，和至少一种编码生物产品途径的酶的外源核酸，其中，所述生物产品途径为巴豆醇途径或使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体。

在其它实施例中，提供了使用工程化微生物生产生物产品的方法，其中巴豆醇是生物产品，或者巴豆醇是生物产品途径中的中间体(例如1,3-丁二烯，1,3-丁二醇，甲基乙烯基甲醇)，该方法包括：

提供工程化微生物，具有至少一种基因修饰，所述基因修饰引起(a)将巴豆醇转化为巴豆醛的醇脱氢酶(ADH)，(b)将丁醛转化为丁醇的ADH(c)将巴豆醛转化为丁醛的烯烃还原酶或(a)、(b)和(c)的任何组合的活性的部分或完全丧失；以及

在生产巴豆醇的条件下，或生产生物产品时使用巴豆醇作为生物产品途径的中间体的条件下，培养工程化微生物。

在一些实施例中，部分或完全丧失活性的醇脱氢酶和烯烃还原酶对微生物是天然的，并且醇脱氢酶能够将巴豆醇转化为巴豆醛和/或将丁醛转化为丁醇，并且烯烃还原酶能够将巴豆醛转化为丁醛。当这些天然活性与期望的酶活性竞争时被认为是非期望的活性，所述期望的酶活性包含向巴豆醇或巴豆醇衍生的生物产品的途径。

该微生物可以被进一步基因修饰以增加将巴豆醛转化为巴豆醇的酶的活性，例如巴豆醛还原酶(醇形成)，特别是在巴豆醛是副产物而不是生物产品途径中间体的情况下。

这些公开的方法和工程化微生物允许巴豆醇水平的生长高于没有基因修饰的微生物。这样的微生物也可以产生显著更多的巴豆醇。此外，所公开的方法和微生物可以通过减少或消除巴豆醇向不期望的或浪费的途径的转化，来提高巴豆醇产率的效率和/或降低工艺成本。

附图说明