[发明专利]用于自动化的外植体制备的系统及使用方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据25USC§119(e)要求2015年6月29日提交的美国专利申请序列号62/186,059的权益，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开整体涉及用于制备用在植物育种中的种子的装置，且更具体地讲涉及用于制备用于基因转化和转基因工程的外植体的装置。

背景技术

大豆(Glycine max)为最重要的农作物之一，全世界有超过2亿公吨的年作物产量和超过400亿美元的估计价值。大豆占全球所有油籽生产的超过97％。因此，用于改良这种有价值的作物的质量和产量的可靠且有效的方法具有显著利益。

用于改良大豆的传统育种方法已受到限制，因为大多数大豆栽培品种仅源自几个亲代品系，从而导致用于育种的窄种源基础。Christou等人，TIBTECH 8:145-151(1990)。现代研究工作已集中于植物基因工程技术以改良大豆生产。转基因方法被设计为将所要的基因引入作物植物的遗传生殖系中以产生优良的植物品系。方法已成功地提高若干其他作物植物对疾病、昆虫和除草剂的抗性，同时改良营养价值。

已开发用于将基因转移至植物组织中的若干方法，包括基因枪(例如高速微粒轰击)、显微注射、电穿孔和直接DNA摄取。近来已使用农杆菌介导的基因转化来将感兴趣的基因引入大豆中。然而，已证明大豆是用于转基因工程的挑战性系统。大豆外植体的有效转化和再生难以实现，且通常难以重复。

作为病原土壤细菌的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有将其称为T-DNA的DNA转移至宿主植物细胞中且诱导宿主细胞产生对细菌营养有用的代谢产物的内在能力。使用重组技术，T-DNA中的一些或全部可以被感兴趣的一个或多个基因替代，从而产生对使宿主植物转化有用的细菌载体。农杆菌介导的基因转移通常针对组织培养中的未分化细胞，但也可针对从植物的叶或茎取得的分化细胞。已开发用于大豆的农杆菌介导的转化的许多程序，这些程序可基于经受转化的外植体组织宽松地分类。

Olhoft等人的美国专利第7,696,408号公开了用于使单子叶植物和双子叶植物两者转化的子叶节方法。“子叶节”(cot node)方法涉及通过以下方式从5-7天大的大豆幼苗移除下胚轴：在子叶节正下方切割，分裂且分开具有子叶的剩余下胚轴区段，并从子叶移除上胚轴。使子叶外植体在腋芽和/或子叶节的区域中受创，且在黑暗中以根癌农杆菌培养五天。该方法需要种子的体外发芽，且创伤步骤引入显著的可变性。

Martinelli等人的美国专利第6,384,301号公开了农杆菌介导的基因从大豆胚传递至活分生组织中，这些大豆胚从大豆种子切除，接着以选择剂和激素培养分生组织外植体以诱导嫩芽形成。类似于“子叶节”方法，优选地使分生组织外植体在接种之前受创。

Paz等人的美国专利第7,473,822号公开了称为“半粒种子外植体”(half-seed explant)方法的修改的子叶节方法。成熟大豆种子经浸润、表面灭菌且沿种脐分裂。在感染之前，完全移除胚轴和嫩芽，但无其他创伤发生。农杆菌介导的转化进行，选择潜在转化体，且在选择培养基上重新产生外植体。

转化效率在这些方法下仍然相对低，对于“子叶节”方法为约0.3％至2.8％，对于“分生组织外植体”方法为1.2％至4.7％，且对于“半粒种子外植体”方法介于3.2％与8.7％之间(整体4.9％)。在本领域中通常为约3％的转化效率。

改良的“分裂种子”(split-seed)转基因方案可使转基因大豆产品的未来生产和发展加速。用于转基因至大豆组织中的稳定整合的有效且高通量的方法将促进育种计划且具有提高作物生产率的潜力。

发明内容

公开一种用于自动化外植体制备的方法和设备。根据一个方面，自动化的外植体制备方法可包括操作泵以用农杆菌溶液填充包括多个外植体的外植体器皿，操作第一机械臂以将经填充的外植体器皿移动至震荡器台的震荡器板上，操作震荡器台以使震荡器板在由震荡器板限定的平面内的方向上移动以便用农杆菌溶液感染所述多个外植体，和响应于确定外植体已被农杆菌溶液感染而操作第二机械臂将外植体从经填充的外植体器皿移动至培养基器皿上的预定位置处。