[发明专利]制备两亲性咪唑啉鎓化合物的方法

说明书

本发明通常涉及改进的制备两亲性咪唑啉鎓化合物，如1‑[2‑(9(Z)‑十八烯酰氧基)乙基]‑2‑(8(Z)‑十七烯基)‑3‑(2‑羟乙基)氯化咪唑啉鎓（DOTIM）的方法。特别地，本发明涉及合成此类化合物的方法，该方法不需要有毒的试剂，更经济，并且导致比常规方法更少的废弃物。DOTIM和类似化合物可以配制为阳离子脂质体，其可以在基因疗法中用作核酸递送的化学媒介物。

发明领域

本发明通常涉及改进的制备两亲性咪唑啉鎓化合物，如1-[2-(9(Z)-十八烯酰氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓（DOTIM）的方法。DOTIM和类似化合物可以配制为阳离子脂质体,，其可以在基因疗法中用作核酸递送的化学媒介物（vector）。

发明背景

基因疗法使用核酸作为基因缺陷和大量获得性疾病的治疗，并包括大的DNA分子（质粒DNA；pDNA），但是也包括小的DNA（寡核苷酸；ODN）和RNA（核糖酶、SiRNA和mRNA）分子。基因疗法的成功很大程度上取决于基因递送媒介物的开发，该媒介物可以是病毒媒介物或非病毒媒介物，如化学载体或通过物理方法递送裸DNA。非病毒媒介物具有超出病毒媒介物的许多优点，包括简单的大规模生产、缺少免疫原性和低毒性。

能够形成带正电荷的脂质体的阳离子脂质是最广泛用于基因递送的非病毒媒介物之一（Zhi等人, Bioconjugate Chemistry, 2013, 24: 478-519）。阳离子脂质是两亲性分子，通常由疏水性域（例如脂族链、类固醇环）、亲水性头基团（例如胺、季铵盐、胍鎓、杂环）和连接这两个域的连接基团（例如醚、酯、氨基甲酸酯或酰胺键）构成。亲水性头基团能够通过与基因的带负电荷的磷酸根基团的静电相互作用来缩合核酸，并进一步控制转染效率。阳离子脂质通常与中性共脂质如二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）或胆固醇一起配制成阳离子脂质体以改善转染。当与带负电荷的DNA混合时，带正电荷的脂质体自发地形成称为脂质体复合物的独特的紧密结构。

Solodin和同事报道了利用咪唑啉鎓阳离子脂质作为合成载体以便将基因递送到细胞中（Solodin等人, Biochemistry, 1995, 34(41): 13537-13544）。这些脂质包括1-[2-(9(Z)-十八烯酰氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烯基)-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓（DOTIM）及其类似物1-[2-(十六烷酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓（DPTIM）和1-[2-(十四烷酰氧基)乙基]-2-十三烷基-3-(2-羟乙基)-氯化咪唑啉鎓（DMTIM）。对体外转染和体内基因递送而言，发现DOTIM是三种化合物中最有效的。DMTIM、DPTIM和DOTIM的结构如下：

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从多官能化合物N,N'-双(2-羟乙基)乙二胺开始制备脂族咪唑啉鎓化合物的方法已经描述在美国专利号5,705,655（Heath）、5,830,878（Gorman）和8,044,215（Yu）中。但是，这些现有技术的方法显示出各种缺点。例如，为了酰化伯羟基而不相伴地酰化更亲核的仲胺，用叔丁氧基羰基保护后者。这些保护基团是常见的，并在本文中称为“BOC”基团。该步骤需要试剂二碳酸二叔丁酯，这是昂贵且有毒的化合物。另外，该BOC保护基团必须在后继步骤中通过酸水解除去，造成额外量的有机和水性废弃物。

此外，这种BOC保护的中间体的酰化程序需要在碱（例如三乙胺）的存在下使用酰基卤，或在N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）的存在下与羧酸反应。在酰化反应中对三乙胺或DMAP的需求导致附加的成本与废弃物。此外，该DCC/DMAP程序导致形成二环己基脲（DCU）作为副产物，并通常需要纯化形成的酯，这可能是耗费劳力的。

因此，存在对于改进的制备和纯化DOTIM与其它两亲性咪唑啉鎓化合物的方法的需求。特别地，存在对于容易规模化、成本有效、环境友好并能够持续产生高度纯的化合物的此类方法的需求。

发明概述