[发明专利]使用混合相固相萃取材料的肽纯化

说明书

本发明涉及一种纯化肽和/或多肽的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：(a)在酸性或中性水性条件下将包含肽和/或多肽的样品装载到混合相固相萃取(SPE)材料上，其中所述材料由反相/离子交换材料组成或包含反相/离子交换材料；(b)用以下洗涤所述混合相SPE材料：(ba)包含至少50％(v/v)有机溶剂的酸性或中性组合物；和/或(bb)酸性或中性水溶液；以及(c)用包含至少50％(v/v)有机溶剂的碱性组合物从所述混合相SPE材料洗脱所述肽和/或多肽。

在本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请和制造商手册。这些文献的公开内容虽然被认为与本发明的可专利性不相关，但是将其全部内容援引加入本文。更具体而言，所有参考文献援引加入，达到如同每个单独的文献被具体地和单独地指明为援引加入一样的程度。

现有技术的自下而上蛋白组学平台通常包含高灵敏度组件，例如纳流高压液相色谱(nano HPLC)系统、电喷雾电离(ESI)源和包含选择四极杆的质谱仪(MS)。这些组件的任何污染都可能导致有价值样品的损失、系统性能下降和整个系统故障，以及耗时的仪器停机时间和延长的维修。

污染化合物可以源自样品本身或用于样品制备的材料。特别是临床上相关的组织和体液含有不期望的物质，例如高含量的盐、脂肪、脂质和糖，其损害色谱法和电喷雾质量。此外，样品处理期间使用的塑料和化学成分可能引入影响LC-MS测量的干扰离子。特别是与LC-MS不相容的洗涤剂可以通过破坏色谱介质或在测量期间泛入仪器并遮掩肽离子而极具破坏性。

干扰离子通常在质谱法中观察到，其经常被称为背景离子。这些离子通常存在于实验室空气中，但是最丰富且可色谱学上分辨的污染离子通常存在于所分析的样品中。如上所述，这些污染离子源自样品处理期间使用的化学品或塑料(Keller,B.O.等，Interferences and contaminants encountered in modern mass spectromentry,Anal Chim Acta,2008.627(1):p.71-81；McDonald,G.R.等，Bioactive contaminants leach from disposable laboratory plasticware,Science,2008.322(5903):p.914；Watson,J.等，Extraction,identification,and functional characterization of a bioactive substance from automated compound-handling plastic tips.J Biomol Screen,2009.14(5):p.566-72)。这些低聚物或聚合物通常质量范围与肽相似，并且可能在LC-MS测量中表现相似。此外，化学标记经常导致在LC-MS测量中非常明显的副产物(Ting,L.等,MS3eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.Nat Methods,2011.8(11):p.934-40)。当如在同位素标记方法中那样将样品汇集或合并时，由于相加作用，这些聚合物的存在更明显，而样品特异性分析物被稀释，导致测量品质差。

干扰离子可以泛入质谱仪，从而遮掩所关注的分析物。此类污染物主要使用专门的塑料器具、纯度优异的化学品而减少，或者通过耗时的蛋白质沉淀步骤而减少。尽管如此，肽水平的沉淀不是可取的，因为小的多肽倾向于不沉淀，因此沉淀会导致严重的样品损失。

沉淀的主要替代方法是结合、洗涤和洗脱的色谱手段。虽然先前已经报道将SPE材料用于脱盐和除去洗涤剂的目的，但是并没有针对除去上面讨论的污染物而对它们进行设计和优化。

高度关注的许多生物样品含有大量的LC-MS污染化合物。特别是临床相关的样品(例如血浆、血清和尿样品)由于脂质、盐、糖和其他代谢物含量高而难以分析(参见表1)。这些污染物经常导致LC柱堵塞，降低质谱仪的性能。这就是为什么这些体液的大规模LC-MS研究不成功或极具挑战性的部分理由。