[发明专利]赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及其应用

说明书

本发明涉及赖氨酸脱羧酶的突变型的生成方法和突变型的特性、对上述赖氨酸脱羧酶的突变型进行编码的基因及利用这些的尸胺的生产方法。本发明提供通过蛋白质工程变异的改善的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶。并且，本发明的突变型赖氨酸脱羧酶在生产尸胺时，增加活性及pH稳定性、热稳定性来提供因收率及生产性增加而带来的生产费用的降低。

技术领域

本发明涉及通过蛋白质工程酶变异的赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及所生成的突变型的特性分析、利用上述突变型酶进行的生物转化反应。

背景技术

近来，在石油资源不断被耗尽时，正在积极进行利用非石油资源的生物材料合成高分子前体的研究。尤其，两个末端具有两个胺基，并且由五个碳组成的尸胺(cadaverine；1，5-diaminopentane)不仅可用作高分子前体，而且可广泛用于化学工业领域。例如，聚酰胺、聚氨酯、螯合剂等。近年来，正在积极进行利用赖氨酸合成尸胺的研究，或者利用与赖氨酸相比费用低廉的葡萄糖或淀粉中的微生物细胞的生物转化功能大量生产尸胺的研究。像这样，以生物转化技术通过宿主的基因突变来大量生产尸胺的方法很多，但是赖氨酸可通过使用如淀粉或葡萄糖等起始材料的生物转化过程的多个步骤来合成，这种赖氨酸可通过多种反应转化为其他化合物，因此被用作主要的起始材料。其一个例子为脱羧反应，并且可通过赖氨酸脱羧酶反应来合成尸胺。在微生物中利用葡萄糖生产赖氨酸的技术可在谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)宿主中以约120g/L的水平生产，并且正在进行商业化大量生产。因此，需要一种能够可将这种高浓度的赖氨酸作为基质来转化为细胞中的多种化合物的技术，或者在试管中能够以一步(one-step)反应更有效地转化为尸胺的技术。

众所周知，谷氨酸棒状杆菌中不包含赖氨酸脱羧酶，但是在多种来源的微生物中包含赖氨酸脱羧酶。其中，尤其，利用磷酸吡哆醛(PLP，pyridoxal-5'-phosphate)辅酶的大肠杆菌(Escherichia coli)来源的赖氨酸脱羧酶的反应性高。在大肠杆菌中，存在两种赖氨酸脱羧酶，上述赖氨酸脱羧酶包含在细胞生长过程中连续表达的LdcC赖氨酸脱羧酶和仅在弱酸性的pH的条件下诱导表达的LdcI赖氨酸脱羧酶。加拿大多伦多大学的Houry研究小组已经揭示了大肠杆菌来源的LdcI赖氨酸脱羧酶的结构，发现上述酶呈现由10个单位组成的十聚体(decamer)形态。可通过赖氨酸脱羧酶所显示的结构及多个氨基酸残基的变异来预测影响酶活性的重要的要素及反应的机制。

在活性比较高的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶LdcI的情况下，当利用于高浓度的工业反应时，存在几个缺点。在弱酸性的条件(pH5.6)下的活性高，但是在中性或碱性条件下，存在快速丧失活性的缺点，因此为了进行高浓度及长时间的重复反应，需要增加LdcI酶的pH及热稳定性，并且需要更高的酶活性。基于这种理由，通过酶的结构性研究来提高整个pH的酶反应性，通过开发热稳定性及pH稳定性得到改善的突变型来应用于高浓度及连续的赖氨酸生物转化反应中。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：韩国公开专利10-2012-0021491

专利文献2：韩国公开专利10-2014-0012099

非专利文献

非专利文献：细菌的酸性压力及其反应：可诱导的赖氨酸脱羧酶的结构，EMBOJ.2011Mar 2；30(5)：931-44

非专利文献：通过pH变化观察N-末端结构来提高大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶B的热稳定性，J Biotechnol.2014 Mar20；174：22-8

发明内容

技术问题