[发明专利]抗体样蛋白质的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种包含弱酸性条件下的洗脱工序的抗体样蛋白质的纯化方法。

背景技术

进行抗体药物开发的核心是单克隆抗体，这些单克隆抗体正是使用重组培养细胞技术等大量地生产出来的。“单克隆抗体”是指由来自单一抗体产生细胞的克隆得到的抗体。由培养细胞生产出的单克隆抗体在利用各种色谱进行纯化后成为药品。色谱中，特别是利用固定化有蛋白A的亲和分离色谱进行的纯化能够一次性将抗体从动物细胞培养物纯化为高纯度，因此在抗体药品的制造中是必不可少的工序。

蛋白A是由革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)所生产的细胞壁蛋白质的1种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)和作为细胞壁结合结构域的XM区构成(非专利文献1)。

已经开发出多种通过蛋白质工程学方式对蛋白A加以改造、从而使其高功能化的技术。例如已知提高蛋白A的耐碱性、提高抗体酸解离特性、通过向固定化点导入变异而提高抗体结合容量等例子(专利文献1～4)。

近年来，细胞培养中的抗体的生产效价在提高，对下游的纯化处理的负担也在增加。在使用固定化有蛋白A的亲和分离色谱的工序中，通常在中性pH下使抗体结合于载体后，在酸性pH下洗脱抗体，从而能够将抗体纯化。但是，已知有部分抗体会在低pH下发生聚集、或者抗体活性降低。这些现象不仅在抗体制造中成为纯化工序的负担(工序数增加、收率降低)，而且作为药品有时会带来严重的副作用。因此，需要能够在更高pH下洗脱的亲和分离色谱载体。已知为了提高抗体酸解离特性而进行33位的Ser的置换、18位的His的置换以及各种氨基酸残基置换为His等方案(专利文献3、5、6)。

对应于蛋白A的Fc结合部位中的C结构域的第9位的Gln向Ala、Thr的置换变异虽然是已知的，但并未公开这些变异体的抗体酸解离特性(专利文献7、非专利文献2)。此外，对应于蛋白A的Fc结合部位中的C结构域的第35位的Lys的置换变异体已知有多种，但这些变异体的抗体酸解离特性并未公开(专利文献8)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:国际公开第03/080655号

专利文献2:欧洲专利第1123389号说明书

专利文献3:国际公开第2011/118699号

专利文献4:国际公开第2012/133349号

专利文献5:国际公开第2012/087231号

专利文献6:国际公开第2012/165544号

专利文献7:国际公开第2015/005859号

专利文献8:日本特开2007-252368号公报

非专利文献

非专利文献1:Hober S.等著、“J.Chromatogr.B”2007年、848卷、40-47页

非专利文献2:O’Seaghdha M.等著、“FEBS J”、2006年、273卷、4831-4841页

发明内容

发明要解决的问题

本发明的问题在于，提供包含弱酸性条件下的洗脱工序的抗体样蛋白质的纯化方法。

用于解决问题的方案

本发明人们对具有氨基酸置换变异的繁多的重组蛋白A变异体的活性进行了比较研究，结果发现，含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列的配体，在酸性pH范围内的抗体结合能力与前述置换前的配体相比降低，从而完成了本发明。

即，本发明涉及一种抗体样蛋白质的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：(a)使抗体样蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质的工序；和(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将抗体样蛋白质洗脱的工序；前述配体含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列，所述配体与前述置换前的配体相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。]优选前述亲和分离基质为在水不溶性基材固定化有配体的载体。

优选水不溶性基材含有合成高分子或多糖类。

优选多糖类为纤维素或琼脂糖。