[发明专利]用于样品制备尤其是用于质谱分析的方式和方法

说明书

技术领域

本发明涉及叔胺在优选用于质谱和/或UV/可见光谱分析的样品制备中作为缓冲剂的用途，其中所述样品包括蛋白质、多肽和/或肽，所述样品制备包括：(a)蛋白质、多肽和肽的变性；及(b)化学同位素标记和/或化学交联，其中所述样品制备不使用伯胺缓冲剂。

背景技术

在本说明书中引用了许多文献，包括专利申请及生产商的手册。这些文献公开的内容，虽然并不被认为与本发明的可专利性相关，在此将其全部内容引入本申请作为参考。更具体而言，所有参考文献作为参考引入本申请的范围和程度如同每篇单独的文献明确且单独地表示作为参考引入本申请。

自下而上的蛋白质组学分析平台在性能和通量方面迅速取得进步。质谱仪在采集速率和灵敏度方面有所改善，从而在更短的时间内达到蛋白质组学分析深度。样品制备是总工作流程的一个非常重要的组成部分，仍然是高通量的基于MS的蛋白质组学分析的限制因素。采用改变分析物质量的同位素标记技术通过样品复用，可以改善通量。于是分析物的生物化学行为几乎相同，但是其质量不同，这可以在质谱仪中观察到。因此，以不同方式同位素标记的样品可以在LC-MS分析之前混合，这导致更高的样品复杂性以及更高的总通量(Ong,S.E.and M.Mann,Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative.Nat Chem Biol,2005.1(5):p.252-62)。

同位素标记技术包括在细胞培养中利用氨基酸的稳定同位素标记(SILAC)(Ong,S.E.,et al.,Stable isotope labelling by amino acids in cell culture,SILAC,as a sample and accurate approach to expression proteomics.Mol Cell Proteomics,2002.1(5):p.376-86)及化学衍生，例如同位素编码的亲和标签(ICAT)(Yi,E.C.,et al.,Increased quantitative proteome coverage with(13)C/(12)C-based,acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagent and modified data acquisition scheme.Proteomics,2005.5(2):p.380-7)及等量异位质量标签(TMT，iTRAQ)(Thompson,A.,et al.,Tandem mass tags:a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.Anal Chem,2003.75(8):p.1895-904；Ross,P.L.,et al.,Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.Mol Cell Proteomics,2004.3(12):p.1154-69)。化学标记已知其复用能力和样品标记选项的多功能性。大多数化学标记试剂是基于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯反应性基团，其反应及以共价方式修饰伯胺基。然而，副产物和化学品背景，尤其是伯胺，会淬灭标记效率，并由此降低测量性能。这些标记试剂的生产商建议在标记之前典型地通过沉淀使蛋白质浓缩及去除任何化学品，从而允许有效地与NHS酯标记物反应。

在色谱及MS分析之前在样品制备中采用的典型的工作流程包括以下步骤。对细胞和组织材料实施裂解。在裂解之前，可以实施交联，如化学交联。交联可以是阐释体内相互作用的手段。典型的用于交联的试剂是NHS酯。在裂解之后，实施变性。二硫化物桥被还原，所得的巯基被烷基化。在许多场合利用胰蛋白酶对所得的材料实施蛋白酶解。然后，可以实施化学同位素标记。假如用于之前的步骤的试剂对化学标记过程造成负面干扰，则必须通过麻烦的纯化步骤实施标记步骤。这一纯化步骤包括沉淀、离心分离和再悬浮。这些步骤不仅是麻烦费力的，并且要求传递(hand-on)时间，而且此外它们典型地要求至少100μg蛋白质；否则存在发生样品损耗及甚至样品完全损耗的巨大风险。

发明内容