[发明专利]用于生成数字荧光图像的方法

说明书

在用于建立数字荧光图像的方法中，将针对每个像素从物平面的发射光转换成分别配属于测量时间点的振幅(I)的序列，并且振幅(I)的序列以彼此错开了至少一个时间偏差(τ)的方式自相关，并且针对其中每个时间偏差(τ)形成特定的相关振幅(Kτ)，由该相关振幅(Kτ)求出总振幅。

技术领域

本发明涉及一种用来由配设有荧光染料的样本生成数字荧光图像(电子图像文件)的方法。

背景技术

荧光显微术是一种用于对蛋白质定位并且绘制组织样本和细胞(下文为样本)内的蛋白质分布的极为有效的光学显微术方法。为此有针对性地将荧光染料输送给有待用显微镜检验的样本，荧光染料与蛋白质对接。通过以依赖于所使用的染料的确定的波长(激发波长)的光(激发光)进行照射来激发这种染料，并且将染料分子(荧光团)的电子提升到更高的能量水平。在短暂的停留时间之后，被激发的电子分别在发射有比激发波长更长的特定波长(发射波长)的光(发射光)的情况下再次达到其最初的水平。单个电子在此发出光量子或光子。这种特性用于使蛋白质或其它物质变得可见。

除了被用于可视地观察样本，荧光显微镜被划分成传统的宽场显微镜和激光扫描显微镜，宽场显微镜带有相机，该相机包括多个以矩阵布置的探测器，激光扫描显微镜仅具有单独的探测器。两种类型的显微镜目前都常见，其中，激光扫描显微镜相比传统的宽场荧光显微镜具有许多优势。

激光扫描显微镜通常是共焦的显微镜，这就是说，激发光的处在物平面中的焦点被成像到共轭的平面中，亦即像平面中，通常带有前置的孔眼光阑的单独的探测器定位在那里。因此仅微小的物场截面的，亦即微小的像素的发射光被导引到探测器上。这相比传统的宽场荧光显微镜具有重要的优势，即，仅探测发射光的来自焦点平面的光量子并且有助于信号形成。以这种方式可以一层一层地用显微镜检测样本并且将由每个用显微镜检测到的层的信号产生的荧光图像聚成三维的图像。

通过如下方式获得每一层的荧光图像，即，通过通常由两个振镜构成的激光扫描系统以一个扫描频率扫描物场，从该扫描频率得出了针对每个像素的像素停留时间。在像素停留时间期间被探测器接收到的发射光通过这个探测器转换成模拟的电探测器信号，模拟的电探测器信号通过获知激光扫描系统的各自的位置而分别配属于一个像素。模拟的探测器信号首先以预定的节拍频率被数字化。为此，在激光扫描显微术领域内原则上公知两种类型的数字化。

第一种类型的数字化是对模拟的探测器信号进行积分。当信号探测的持续时间(探测时间)处于和像素停留时间相同的数量级时，也就是说探测时间仅比像素停留时间稍短时，就使用第一种类型的数字化。由在此通过模拟信号形成的积分值和探测时间可以利用对探测器进行一次读取推导出每个像素的平均值(平均值振幅)，该平均值是配属于该像素的总振幅。

在过去，基于荧光染料的仅很小的辐射强度，尤其使用积分这种方法，因为可以形成较高的总振幅。

第二种类型的数字化是对模拟的探测器信号进行快速的扫描(取样)。当探测时间明显较短，特别是比像素停留时间短了若干数量级时，优选使用第二种类型的数字化。然后在像素停留时间内在多个测量时间点上(信号探测的持续时间被简化地视作时间点，或者测量时间点是读取探测器的时间点)分别产生振幅，并且由振幅序列形成了平均值(平均值振幅)，该平均值作为总振幅分别配属于像素。

这种快速的扫描当前在激光扫描显微术中是常见的，因为在使用现代模数转换器时该方法的优点占优势。

典型地转换具有恒定的采样率的探测器信号，该恒定的采样率明显比最短的可能的像素停留时间高了优选至少一个数量级，尤其两个数量级。每个像素的测量时间点的数量然后由像素停留时间得出。这又通过扫描设定(帧率、像素数、扫描尺寸)来确定。像素停留时间的提高然后导致了每个像素的测量时间点的数量的提高。

为了改善信噪比，通常提高像素停留时间。缺陷在于，用于获得呈网格图形的形式的由所有像素的总振幅形成的荧光图像的总时间因此提高且帧率减小。信噪比由一方面由发射光导致且另一方面由噪音导致的份额占总振幅的比例确定。