[发明专利]二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体、和利用了该变异体的烯烃化合物的制造方法

说明书

本发明的目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的方法、和用于该方法的酶，对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多种MVD的变异体。然后，对于变异体评价参与异戊二烯等烯烃化合物的生成的催化活性，结果发现，209位的苏氨酸被替换成其他氨基酸的MVD具有上述催化活性，表明了除了209位以外进一步74位的精氨酸也被替换成其他氨基酸的MVD具有更高的上述催化活性。

技术领域

本发明涉及利用了二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体的烯烃化合物的制造方法。另外本发明涉及上述变异体及其制造方法，进一步还涉及编码上述变异体的DNA、和插入了该DNA的载体。另外本发明涉及利用导入了上述DNA或上述载体的宿主细胞的烯烃化合物的制造方法，进一步还涉及包含上述变异体、上述DNA或上述载体的用于促进烯烃化合物的生成的制剂。

背景技术

异戊二烯、异丁烯等烯烃化合物作为合成橡胶等各种合成聚合物的原料极为有用，这些化合物可以通过石油分馏这样的化学方法得到。

然而，即使在这样的化学方法中，其收率也低，花费制造成本，另外需要时间。进而考虑近来的环境问题，要求开发不浪费有限资源的、对环境温和的可持续的烯烃化合物的制造方法以代替化学方法。

鉴于这种状况，尝试了利用或改变微生物等的代谢途径来制造烯烃化合物。例如，开发了对参与甲羟戊酸途径的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶等导入变异，利用该变异酶的异戊二烯、异丁烯等的制造方法(专利文献1～3)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2013/092567号

专利文献2：国际公开第2015/004211号

专利文献3：国际公开第2015/021045号

发明内容

发明要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术存在的课题而做出的，目的是提供能以高生产率制造烯烃化合物的酶。

用于解决课题的方法

本发明者们为了实现上述目的，首先构想了将以5-二磷酸甲羟戊酸为底物、由二磷酸甲羟戊酸脱羧酶参与的异戊烯基二磷酸的生成(参照下述式)应用于异戊二烯等烯烃化合物的制造。

即，在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的氨基酸中导入变异，使该酶(二磷酸甲羟戊酸脱羧酶变异体)的底物特异性从原来的针对5-二磷酸甲羟戊酸变更为针对3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸等，从而经过如下述式所示的反应而制造异戊二烯等。

因此，本发明者们在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的各部位导入伴随氨基酸替换的变异，制备了多个二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的变异体。然后，对于这些变异体，评价参与以5-二磷酸甲羟戊酸为底物生成异戊烯基二磷酸的催化活性、和以3-羟基-3-甲基戊-4-烯酸为底物生成异戊二烯的催化活性。

其结果表明，通过在二磷酸甲羟戊酸脱羧酶中导入变异，针对5-二磷酸甲羟戊酸的底物特异性总的来说降低。特别是发现，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶的209位的苏氨酸被替换成其他氨基酸(丝氨酸、精氨酸、组氨酸等)的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶具有生成异戊二烯的催化活性。

进而表明，74位的精氨酸被替换成组氨酸、且209位的苏氨酸被替换成精氨酸的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(R74HT209R)出类拔萃地显示极高的参与异戊二烯的生成的催化活性。更具体地，通过对二磷酸甲羟戊酸脱羧酶导入上述双重变异，参与异戊烯基二磷酸的生成的催化活性与野生型相比变为约3分之1，另一方面，参与异戊二烯的生成的催化活性与野生型相比提高到约60～80倍。另外，该参与异戊二烯的生成的催化活性如后述图3B和图4B所示，与其他变异体相比显著高。