[发明专利]诱导的扩展的多潜能干细胞、制备及使用方法

说明书

用于在体外培养后扩展分离的多潜能干细胞在体内产生胚外谱系的能力的因子(在本文中称为多潜能性的化学扩展剂(CEP))。扩展多潜能细胞产生胚胎谱系和胚外谱系的能力的方法。待重编程的细胞与有效量的CEP接触足够的时间段以将细胞重编程为化学诱导的扩展的多潜能干细胞(ciEPSC)。基于包括以下的性质将ciEPSC鉴定为扩展的多潜能细胞：(i)形态学上和(ii)功能上，例如基于它们在体内贡献TE和ICM二者的能力。可以培养或诱导ciEPSC以分化成所需类型的细胞，并且用于许多应用，包括但不限于细胞疗法和组织工程。

发明领域

本发明总体上涉及用于扩展体外培养的多潜能(pluripotent)干细胞的体内多潜能性的组合物和方法。

发明背景

早期胚胎中的全潜能(totipotent)细胞是所有干细胞的祖先，并且能够发育为整个生物体，包括胚外组织(诸如胎盘)。内细胞团(ICM)中的多潜能细胞是全潜能细胞的后代并且能够分化成除胚外组织之外的身体的任何细胞类型。

动物发育通过精子对卵子的受精作用来启动，紧接着是有丝细胞分裂或卵裂，以产生卵裂球。在大多数动物中，细胞类型多样化的第一步是创造原胚层，即内胚层、中胚层和外胚层。通常，内胚层是营养吸收所必需的胃肠道的前体；中胚层产生分别参与运动和心血管循环的肌肉和血细胞；并且外胚层分别发育成对于免受环境危害和感知环境至关重要的表皮和神经元。因此，所述三种胚层的形成为产生动物生命所必需的各种组织奠定了基础，并且是在动物发育开始时发生的进化上保守的事件。

然而，对于哺乳动物的发育，特别是真哺乳亚纲动物(诸如小鼠和人类)的发育，情况略有不同。哺乳动物发育的第一个细胞分化事件不是形成所述三种胚层，而是建立两种不同的细胞谱系：滋养外胚层(TE)和内细胞团(ICM)。TE通过直接与母亲的子宫相互作用来参与着床，并且产生胎盘中的组织。只有在植入之后所述三种胚层才由ICM形成，最终产生动物体内的所有组织。综述于Marikawa等人,Mol.Reprod.Dev.,76(11):1019-1032(2009)。

ESC(胚胎干细胞)是存在于胚泡的ICM中的多潜能细胞的体外对应物。虽然正在发育的胚胎中的天然多潜能细胞短暂地存在，但是ESC能够在体外维持，这提供了未分化细胞的无限来源。Tachiban等人,Cell,148(1-2):285-295(2012)。分离的体外培养的多潜能干细胞的下游应用依赖于它们的潜能，即它们分化成其它细胞类型的能力以及通过它们体外快速扩增细胞的难易度/体外快速扩增细胞的能力。形成畸胎瘤和嵌合体二者的细胞体内分化是评价细胞发育潜能的基本且可靠的工具。几项研究已经证明培养的多潜能干细胞产生全部三种胚胎胚层的能力(Takashima等人,Cell,158:1254-1269(2014)；Chan等人,CellStem Cell,13:663-675(2013)；Theunissen等人,Cell Stem Cell15:471-487(2014)；Evans等人,Nature,292:154-156(1981)，Li等人,Cell,135:1299-1310(2008)；Buehr等人,Cell,135:1287-1298(2008)；和Thomson等人,Science,282:1145-1147(1998)。然而，体外培养的多潜能干细胞显示由例如通过形成嵌合体和/或在体内产生胚外谱系的无能性确定的有限/限制的细胞潜能，由通过它们形成嵌合体的无能性/无效性确定的有限的发育潜能，和/或呈现与体外快速扩增细胞的能力、培养中稳定维持细胞有关的限制性，这限制了这些细胞的下游应用。例如，研究表明多潜能细胞，诸如幼稚NHSM(幼稚人干细胞培养基)-hES(人胚胎干)细胞，不能贡献嵌合小鼠胚胎中的TE(滋养外胚层)和ICM(内细胞团)二者(Gafni等人,Nature,504(7479):282-6(2013))。外胚层干细胞(EpiSC)容易形成畸胎瘤，然而，它们很少形成嵌合体。Han等人,(Cell,143:617-627(2010))描述了EpiSC的亚群，其构成培养物中的约99％(EpiSC)并且显示未贡献嵌合体。作为另外的实例，细胞解离后人胚胎干细胞的存活不佳妨碍了进一步的操作和开发。