[发明专利]经改进的维生素生产

说明书

本发明提供了经改进的核黄素(在本文中也称为维生素B2)的生物技术生产，其使用遗传工程微生物，特别是选自Bacillus的微生物，例如Bacillus subtilis。使用所述经修饰的微生物时，核黄素5产生的产率能够增加至少5％。本发明涉及经修饰的微生物、生成所述经修饰的微生物的方法及其用于生产核黄素的用途。

本发明提供了经改进的核黄素(在本文中也称为维生素B2)的生物技术生产，其使用遗传工程微生物，特别是选自Bacillus的微生物，例如 Bacillus subtilis。使用所述经修饰的微生物时，核黄素产生的产率能够增加至少5％。本发明涉及经修饰的微生物、生成所述经修饰的微生物的方法及其用于生产核黄素的用途。

核黄素由所有植物和许多微生物合成，但是不被高等动物所生产。核黄素是基础代谢必需的，因为它是碳水化合物的酶促氧化中需要的辅酶(例如黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸)的前体。在高等动物中，核黄素供应不足可引起脱发、皮肤炎症、视力衰退和生长障碍(growth failure)。

核黄素的生物合成从三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖开始。参与核黄素生物合成的基因已知来自多种来源，例如Bacillus subtilis， Ereothecium ashbyii，Ashbyagossypii，Candida flareri，Saccharomyces cerevisiae，E.coli(见例如EP 405370、EP1186664中的图2或Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第7版,2007,维生素章节)。

以Bacillus subtilis中的情况作为产生核黄素的(微)生物的一个例子，参与核黄素生物合成的基因包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和 ribH。ribA基因编码两种酶活性，即催化核黄素生物合成中第一步的GTP 环式水解酶II和催化5-磷酸核酮糖转化成3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(DHBP) 的3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸合酶(DHBPS)。脱氨酶和还原酶由操纵子的第一个基因ribG(ribD)编码。核黄素生物合成的倒数第二步由2,4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶催化，所述2,4-二氧四氢蝶啶合酶是ribH的基因产物。催化途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因ribB(ribD)编码。位于rib操纵子3'端的ribT的功能目前是不清楚的；然而，其基因产物不是核黄素合成所必需的。

核黄素操纵子从rib启动子(P_rib)起的转录由核糖开关(riboswitch)控制，所述核糖开关涉及位于rib操纵子5'区中几乎300个核苷酸的非翻译调节前导区(下文中称作rib前导区)，其在转录起点和操纵子中第一个基因ribG的翻译起始密码子之间。新生核黄素RNA的延伸依赖于是否存在FMN或FAD：当这些效应物存在时，转录终止发夹形成(所谓的rib终止子)；当它们不存在时，形成所谓的反终止子，导致rib操纵子的读通转录。

使用微生物(例如Bacillus菌株)建立工业生产工艺需要对宿主菌株和/或工艺条件进行一些修饰(参见例如Kil等人,Mol Gen Genet 233,483- 486,1992；Mack等人,J.Bacteriol.,180:950-955,1998)。

最近，可以表明：rib前导区3’端的序列在核黄素生物合成中起重要作用。有趣的是，仅缺失所谓的终止子并没有使核黄素产生显著增加(参见 WO2010/052319)。

但是，仍然需要进一步优化通过发酵获得的核黄素的工业生产。

因此，持续需要寻找经改进的生产菌株，例如，Bacillus，优选B. subtilis菌株。

出乎意料地发现：转录终止因子Rho在核黄素的发酵生产中，特别是在使用Bacillus、优选B.subtilis菌株的方法中起着重要作用。