[发明专利]用于分析物检测的方法和试剂盒

说明书

本发明涉及用于分析物检测的方法和试剂盒。更准确地说，本发明涉及检测分析物的方法，其包括在环境温度下，在固体载体上存储短单链核酸(10‑100 nt)，例如适配体和微RNA；并且随后扩增用于检测一种或多种分析物的所述核酸。

发明领域

本发明涉及用于分析物检测的方法和试剂盒。更准确地说，本发明涉及检测分析物的方法，其包括在环境温度下，在固体载体上存储短单链核酸(10-100 nt)，例如适配体和微RNA；并且随后扩增用于检测分析物的所述核酸。

发明背景

生物样品存储和保存是合乎需要的，因为保存的样品可用于各种应用，例如分析物检测、传感、法医和诊断应用，基因组测序，全基因组扩增等。

目前使用的在纸基材上保存样品的一些装置是可以获得的。多孔或无孔的基材通常用于保存生物样品，例如纸卡片或膜。纸卡片或膜的实例包括用于保存核酸样品的化学处理的FTA®和FTA®Elute纸(GE Healthcare)，和用于保存血液样品的FTA®DMPK卡片和903®卡片(GE Healthcare)。基材采用吸收和干燥布置在基材上的湿润生物样品，例如血液、口腔内药签或浸渍的组织的方法。

滚环扩增(RCA)是由DNA聚合酶介导的等温DNA扩增过程，其中ssDNA经由圆形模板合成。它被用于超敏DNA检测分析中的信号扩大。RCA已经适应了扩增编码DNA适配体和DNA/RNAzymes的序列。[滚环扩增：在纳米技术和具有功能性核酸的生物检测中的应用(Rollingcircle amplification: Applications in Nanotechnology and Bio-detection withfunctional nucleic acids). Zhao W等人，2008. Angew Chem Int Ed 47, 6330-6337]。

适配体是能够结合一系列不同的化学和生物化学部分如蛋白、小分子量化合物、代谢物、化学化合物等的单链核酸(ssDNA或ssRNA)分子。这种结合事件是适配体和分析物特异性的且可被加工为高度特异性的，具有高亲和力。因此适配体与单克隆抗体分享许多可比较的特性且现在被认为是其中习惯使用抗体的许多过程中的可行的备选物。

适配体可被设计以结合相同目标分子上的不同的表位，促进可与基于免疫学的ELISA比较的检测系统的产生。将荧光团结合到扩增的适配体中或通过生成适配体基DNAzymes (转化报告体染料的催化酶)和核糖酶来生成检测系统。结合不同的分析物和非重叠检测试剂的适配体的使用将支持被设计以检测在相同反应容器中的不同试剂的多路分析。

指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment) (SELEX)是在分子生物学中生产单链DNA或RNA的寡核苷酸的组合化学技术，所述寡核苷酸特异性地结合到一个或多个目标配体。该过程用非常大的寡核苷酸库的合成开始，所述寡核苷酸库由通过用作引物的恒定5'和3'末端侧接的随机生成的固定长度的序列组成。对于随机生成的长度n的区域，在所述库中的可能的序列的数目是4n(在每个位置具有4种可能性(A、T、C、G)的n个位置)。在所述库中的序列被暴露于目标配体(其可以是蛋白或小的有机化合物)和不结合靶标的那些通常通过亲和色谱除去。洗脱结合的序列并通过核酸扩增富集以准备后续的选择循环，其中洗脱条件的严格性增加以鉴定最紧密结合的序列。

然而，使用短的核酸如特异性适配体和适配体库存在稳定性的问题，且迫切希望有一个解决方案，即在SELEX富集、选择和检测过程之前和期间使得适配体在环境温度下长期稳定。

发明概述