[发明专利]蛋白质保持扩展显微法

说明书

本发明提供被称为蛋白质保持ExM(proExM)的方法，其中使用交联分子将蛋白质，而不是标记物锚定到可溶胀的凝胶。这种proExM策略可用于进行免疫染色细胞和组织以及表达FP的样品的纳米级成像，因为即使当经受非特异性蛋白质水解消化时，来自直接锚定到凝胶的基因编码荧光蛋白和/或常规荧光标记二级抗体和链霉亲和素的荧光信号得以保持。

相关申请

本申请要求2015年8月7日提交的美国临时申请序列号62/202,423的优先权益，其内容以引用的方式整体并入本文。

政府资助

本发明是在由Hertz Foundation、NYSCF、NSF和Rehabilitation Institute ofChicago授予的NYSCF-R-NI10和由NIH和Cargill Fund Bioengineering Fund授予的1-U01-MH106011的政府支持下完成的。政府对本发明拥有某些权利。

背景技术

扩展显微法(ExM)可以～70nm横向分辨率来对厚的保存标本成像。使用ExM，通过在成像之前物理扩展生物样本来规避光学衍射极限，从而使亚衍射限制结构达到可通过常规衍射限制显微镜来观察的尺寸范围。ExM可以以衍射限制显微镜的体素率但是以超分辨率显微镜的体素尺寸来对生物标本成像。扩展样品是透明的，并且与水的折射率匹配，因为扩展材料是99％的水。原始ExM协议通过使用可凝胶锚定的荧光团标记感兴趣的生物分子来运作。然后，在样品中合成可溶胀的聚电解质凝胶，从而它将标记物并入。最后，用非特异性蛋白酶处理样品以使其机械特性均匀，接着在水中透析以介导聚合物-样本复合物的均匀物理扩展。除了可凝胶锚定的标记物以外，ExM所需的所有化学品都可以购买，这种标记物需要定制合成并且对研究人员采用所述方法造成了障碍。ExM协议的另一个缺点是基因编码的荧光团不能在没有抗体标记的情况下成像。另外，ExM不能在凝胶中保持天然蛋白质，并且使用不能广泛获得的定制试剂。因此，需要利用ExM来设计将样品内的核酸和蛋白质保持在原位并且加以成像的新方法。

发明概述

本发明提供被称为蛋白质保持ExM(proExM)的方法，其中使用交联分子将蛋白质，而不是标记物锚定到可溶胀的凝胶。这种proExM策略可用于进行免疫染色细胞和组织以及表达FP的样品的纳米级成像，因为即使当经受非特异性蛋白质水解消化时，来自直接锚定到凝胶的基因编码荧光蛋白和/或常规荧光标记二级抗体和链霉亲和素的荧光信号得以保持。

在一个实施方案中，本发明提供用于感兴趣的样品的蛋白质的保持和成像的方法，其包括以下步骤：使样品内的蛋白质与双官能交联剂缀合；使样品包埋在可溶胀材料中，其中样品内的蛋白质锚定到可溶胀材料；使样品经受消化；使可溶胀材料溶胀以形成扩展样品；并且使感兴趣的样品成像。

附图简述

从如在附图中示出的本发明的优选实施方案的以下更加具体的描述中将明白本发明的前述和其它目的、特征以及优点，在附图中相似元件符号指代不同视图中的相同部分。附图未必按比例绘制，而是将重点放在示出本发明的原理上。

专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要费用后，本事务所将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。

图1：38g/100mL丙烯酸钠储备溶液：合适(澄清，左)和低纯度(淡黄色，右)。

图2：是凝胶腔室的示意图。

图3a-图3c：使用高压灭菌版的组织破坏方案，扩展之前(a)和之后(b)，Thy1-YFP-表达大脑组织的落射荧光图像(仅绿色通道)。扩展后共焦图像(c)。扩展组织是使用针对绿色荧光蛋白(GFP，绿色)、GAD65/67(红色)和SV2(蓝色)的一级抗体染色的抗体。比例尺：(a)50um，(b)500um扩展前(2.2mm扩展后)，(c)10um扩展前(44um扩展后)。