[发明专利]用于鉴定IDO1和/或TDO调节剂的筛选测定法

说明书

本发明提供了用于鉴定吲哚胺2,3‑双加氧酶1(IDO1)和/或色氨酸2,3‑双加氧酶(TDO)调节剂的基于细胞的方法。

技术领域

本发明涉及用于鉴定吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)和/或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)特异性调节剂的基于细胞的筛选测定法。

背景技术

吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)和色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)是细胞质的含血红素的酶，其催化色氨酸(Trp)氧化裂解成N-甲酰犬尿氨酸(NFK)，这是犬尿氨酸(Kyn)途径的第一步。Trp的消耗和Kyn代谢物的形成导致效应T细胞功能的抑制和调节性T细胞的分化。肿瘤细胞中IDO1和/或TDO表达的增加水平与癌症中存活预后不良相关。IDO已被临床验证为癌症的小分子药物靶标，而临床前研究表明TDO可能是癌症免疫疗法的靶标(参见etal,2009；Platten et al,2014的综述及其中的参考文献)。

Pilotte等，2012)描述了用于测试IDO1和TDO抑制剂的低通量质谱和高效液相色谱(HPLC)测定法。

本发明要解决的问题是提供用于鉴定IDO/TDO特异性调节剂的高通量兼容测定法。

概述

本发明提供了用于鉴定吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)和/或色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)调节剂的基于细胞的方法，包括：

a.提供重组表达IDO1和/或TDO的细胞，其中所述IDO1和/或TDO表达是可诱导的，

b.使步骤a)的细胞与测试化合物和IDO1和/或TDO底物接触，

c.使步骤b)的混合物与犬尿氨酸感受器接触，

d.测量步骤c)的混合物的荧光读数，其中在候选化合物存在下与空白相比改变的荧光读数指示IDO1和/或TDO活性的调节剂。

在本发明的一个具体实施方案中，细胞是HepG2细胞。

在本发明的一个具体实施方案中，诱导型IDO1和/或TDO表达是由于Tet-on系统。

在本发明的一个具体实施方案中，犬尿氨酸感受器是7-(二乙基氨基)-4-乙基硫基-2-氧代-色烯-3-甲醛(感受器1)。

在本发明的一个具体实施方案中，荧光在Ex:520-560nm和Em：580-680nm测量。

在本发明的一个具体实施方案中，未诱导的细胞被用作空白。

在本发明的具体实施方案中，IDO1和/或TDO是人IDO1和人TDO。

在本发明的一个具体实施方案中，重组表达IDO1和/或TDO的细胞是稳定的细胞系。

在本发明的具体实施方案中，在步骤d)中测量步骤c)的混合物的上清液的荧光读数。

在本发明的一个具体实施方案中，该方法在微量滴定板中进行。

在本发明的一个具体实施方案中，与空白相比，候选化合物存在下的荧光读数降低指示IDO1和/或TDO抑制剂。

在本发明的一个具体实施方案中，与空白相比，候选化合物存在下荧光读数增加表明IDO1和/或TDO激活剂。

在本发明的一个具体实施方案中，IDO1和/或TDO底物是色氨酸。