[发明专利]OmpG变体

说明书

本发明提供了变体OmpG多肽、包含OmpG变体多肽的组合物和使用变体OmpG多肽作为纳米孔用于确定单链核酸的序列的方法。变体OmpG纳米孔会相对于它们的来源亲本OmpG多肽减小离子电流噪音，并由此实现单个核苷酸分辨率的多核苷酸测序。减小的离子电流噪音也会提供这些OmpG纳米孔变体在其它单分子感知应用（例如，蛋白测序）中的用途。

技术领域

提供经工程改造的单体纳米孔变体用于确定核酸和蛋白的序列。

背景

蛋白纳米孔已经变成能够研究化学和生物学中的基础问题的有力单分子分析工具。具体地，因为其在单个生物分子（诸如DNA、RNA和蛋白）的检测和分析中的潜在应用，纳米孔已经吸引了大量注意。

通过观察流过的离子电流的调节或在施加电势过程中的跨孔电压，实现使用单个纳米孔的分子检测。通常，将跨不透性膜的纳米孔放在两个含有电解质的室之间，并使用电极跨所述膜施加电压。这些条件导致穿过所述孔的离子通量。可以驱动核酸或蛋白分子穿过所述孔，且将所述生物分子的结构特征观察为跨膜电流或电压的可测量变化。

纳米孔测序的一个挑战是在单个碱基水平分辨核苷酸序列。阻碍单个核苷酸碱基的分辨的因素之一是穿过纳米孔的离子电流的波动，其为纳米孔的结构所固有的。

发明概述

本发明提供了变体外膜蛋白G (OmpG)多肽、包含OmpG变体多肽的组合物和使用变体OmpG多肽作为纳米孔用于核酸(例如，DNA、RNA)和/或聚合物(例如，蛋白)测序和计数的方法。变体OmpG纳米孔会减小它们所来源的亲本OmpG多肽的离子电流噪音。

在一个方面，本发明提供了变体OmpG多肽。在一个实施方案中，提供了SEQ ID NO:2的亲本OmpG的分离变体或其同系物，其中所述变体包含氨基酸216-227中的一个或多个的缺失、氨基酸置换E229A和氨基酸R211、E15、R68、Y50、E152、E174、E17、D215、Y259、K114、E174、F66和E31中的一个或多个的突变，且其中所述变体保留形成纳米孔的能力。在某些实施方案中，所述OmpG变体与SEQ ID NO:2的OmpG具有至少70%同一性。在其它实施方案中，所述变体OmpG包含SEQ ID NO:16的接头-His-SpyTag构建体。

在另一个实施方案中，提供了SEQ ID NO:2的亲本OmpG的分离变体或其同系物，其中所述变体包含氨基酸216-227中的一个或多个的缺失、氨基酸置换E229A和氨基酸D215的缺失，且保留形成孔的能力。所述分离的变体还可以包含SEQ ID NO:2的氨基酸R211、E15、R68、Y50、E152、E174、E17、D215、Y259、K114、E174、F66和E31中的一个或多个的突变。在某些实施方案中，所述OmpG变体与SEQ ID NO:2的OmpG具有至少70%同一性。在其它实施方案中，所述变体OmpG包含SEQ ID NO:16的接头-His-SpyTag构建体。

在某些实施方案中，所述分离的OmpG变体包含氨基酸216-227中的一个或多个的缺失和置换Y50K。在其它实施方案中，所述OmpG变体还包含D215的缺失。