[发明专利]α-溶血素变体

说明书

本文描述了具有突变的寡聚化结构域的、经工程改造的α‑溶血素亚基，其用于在脂质双层中组装成七聚体纳米孔。

技术领域

公开了与金黄色葡萄球菌（Staphylococcal aureus）α-溶血素变体和αHL突变变体相关的组合物和方法。所述α-溶血素（α-HL）变体可用作例如用于测定聚合物序列信息的装置中的纳米孔（nanopore）。所述αHL突变变体可用于操作亚基的化学计量学以提供有功能的七聚体αHL孔。本文所述的纳米孔、方法和系统采用具有改进的特征的基于纳米孔的单分子技术提供单链核酸如DNA、RNA等的定量检测。

背景

溶血素是由多种生物体生产的蛋白毒素家族的成员。一些溶血素（例如α溶血素）可以通过在膜中形成孔或通道来破坏细胞膜（例如，宿主细胞膜）的完整性。由成孔蛋白在膜中形成的孔或通道可以用于将某些聚合物（例如，多肽或多核苷酸）从膜的一侧运输到另一侧。

α-溶血素（α-HL、a-HL、αHL、aHL或α-HL）是在宿主细胞膜中形成水性通道的自组装毒素。α-HL已成为纳米孔测序界的主要组分。它具有许多有利的性质，包括高稳定性、自组装和足够宽以容纳单链DNA、但不容纳双链DNA的孔径(Kasianowicz等人, 1996)。

以前关于a-HL孔中DNA检测的工作已经集中在分析随着DNA通过孔转移的离子电流特征(Kasianowicz等人, 1996, Akeson等人, 1999, Meller等人, 2001)，这在给定转移速率(在100 mV为~1 nt/ μs)和离子电流信号中的固有噪声的情况下是一项非常困难的任务。通过掺入永久束缚到孔内部的探针分子，已经在基于纳米孔的传感器中实现了更高的特异性(Howorka等人, 2001a和Howorka等人, 2001b; Movileanu等人, 2000)。

野生型a-HL导致显著数目的缺失错误，即没有测量到碱基。因此，需要具有改进的性能的α-HL纳米孔。

发明概述

本发明表征了含有氨基酸变异的突变葡萄球菌α溶血素(αHL)多肽，其增强穿入时间（time to thread，TTT），例如减少捕获目标分子的时间，例如，相对于亲本或野生型αHL的TTT。

本文公开的变体减少目标分子（例如，各种带标记的核苷酸或要测序的核苷酸）的穿入时间（time thread）。

本文中公开了α-溶血素(αHL)变体。所述α-溶血素(αHL)变体源自亲本α-HL多肽，例如，SEQ ID NO: 3，且包含相对于亲本α-HL多肽的一个或多个突变。在某些实施方案中，所述变体包括在与SEQ ID NO: 3 (成熟的a-HL)的位置12或17对应的位置处的置换。在某些实施方案中，所述变体还包含置换H144A。在某些实施方案中，所述置换包含一个或多个正电荷。在某些实施方案中，所述变体包含在与残基T12和/或N17中的一个或多个对应的位置处的置换。在某些实施方案中，所述变体包含选自T12K、T12R、N17K、N17R和它们的组合的置换。在某些实施方案中，所述变体具有相对于亲本α-溶血素改变的穿入时间(TTT)。在某些实施方案中，所述TTT减少。在某些实施方案中，所述变体包含在与来自金黄色葡萄球菌的α-溶血素(αHL) (SEQ ID NO: 1和3)中选自T12R或T12K和/或N17R或N17K的残基对应的位置处的置换。在某些实施方案中，所述置换是T12K。在某些实施方案中，所述置换是T12R。在某些实施方案中，所述置换是N17K。在某些实施方案中，所述置换是N17R。在某些实施方案中，与亲本α-溶血素相比具有改变的特征的变体a-HL (例如，AAA26598)包含H144A和至少一个选自以下的另外突变

a. T12K/R；