[发明专利]抗蛋白酶的链霉亲和素

说明书

本发明涉及一种抗Lys‑C或其他蛋白酶切割的改性的链霉亲和素分子。这些改性的链霉亲和素分子可以通过化学修饰天然链霉亲和素、通过化学合成或通过基因工程来制备。本发明还涉及编码这些改性的链霉亲和素分子的核酸分子，涉及包含这些核酸分子的载体，以及涉及包含这些核酸分子或载体的细胞。本发明进一步涉及一种包含改性的链霉亲和素分子的固相载体和试剂盒。本发明还涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在捕获/固定蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多核苷酸(例如DNA，RNA或PNA)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物和小分子、天然分子和合成分子中的用途，以及涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在质谱分析中用于鉴定与前述(生物)分子相互作用的蛋白质的用途。本发明还涉及一种通过使用改性的链霉亲和素分子来降低质谱分析背景的方法。

技术领域

本发明涉及抗Lys-C或其他蛋白酶切割的经改性的链霉亲和素分子。这些改性的链霉亲和素分子可以通过对天然的链霉亲和素化学修饰、通过化学合成或通过基因工程来来制备。本发明还涉及编码这些改性的链霉亲和素分子的核酸分子，涉及包括这些核酸分子的载体，以及涉及包含这些核酸分子或载体的细胞。本发明进一步涉及包括所述改性的链霉亲和素分子的固相载体和试剂盒。本发明还涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在捕获/固定蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多聚核苷酸(DNA、RNA或PNA)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物和小分子、天然分子和合成分子中的用途，和涉及所述改性的链霉亲和素分子或所述固相载体在质谱分析中用于鉴定与上述(生物)分子相互作用的蛋白质的用途。本发明进一步涉及一种通过使用所述改性的链霉亲和素分子来降低质谱分析中的背景的方法。

背景技术

质谱分析是在蛋白质分析中的一种确定的方法。然而，对于质谱分析来说，全长蛋白通常太大。因此，全长蛋白通常会用蛋白酶消化以获得适合分析的较小片段。

目前的发明人通常采用用生物素标记待分析的靶蛋白的方案。利用生物素和链霉亲和素之间的强亲和力通过亲和层析来纯化生物素化的蛋白质。这是通过使用具有共价连接了链霉亲和素的载体材料的亲和柱或通过使用共价连接了链霉亲和素的珠子来实现的。为了生成适合于质谱分析的蛋白质片段，在生物素化的靶蛋白与链霉亲和素结合时，或者在将生物素化的蛋白质从这些柱子或载体洗脱之后，可以将蛋白酶(例如LysC或胰蛋白酶)直接应用于亲和柱或珠子。

然而，蛋白水解消化不仅能够切割靶蛋白，而且能够切割共价结合到载体材料或珠子上的链霉亲和素。链霉亲和素的蛋白水解片段在随后的质谱分析中形成不期望的背景。即使在蛋白酶处理之前，将所述链霉亲和素从珠子/载体上洗脱，也经常会观察到链霉亲和素蛋白片段的背景，因为尽管存在共价连接，链霉亲和素依然会从珠子/载体上泄漏出来。据推测，发生泄漏是因为链霉亲和素是四聚体，而其中只有一个亚基共价连接到珠子或载体材料上。

发明人还采用了一种实验方案来鉴定与感兴趣的分子相互作用的蛋白质。为此，用生物素标记感兴趣的分子并使其结合到共价连接了链霉亲和素的载体材料或珠子上。然后使含有潜在的相互作用配体的样品与载体材料或珠子接触，以捕获潜在的蛋白质相互作用配体。然后蛋白质相互作用可以进行蛋白水解消化(任选地，在从载体材料或珠子上洗脱之后)，并且可以通过质谱分析来分析所述蛋白水解片段。无论蛋白水解消化是在珠子/载体上进行，还是在蛋白相互作用配体洗脱后进行，经常都能再次观察到不期望的链霉亲和素片段的背景。

本发明的技术问题

本发明的发明人现在已经找到了一种制备能够抗蛋白酶切割(尤其是抗LysC和/或胰蛋白酶切割)的改性的链霉亲和素分子的方法，同时仍然维持对生物素的高结合亲和力。

本发明的新型改性的链霉亲和素非常适用于蛋白质纯化中，尤其适用于随后通过质谱分析进行的蛋白质鉴定中。然而，新型的改性的链霉亲和素可以有利地应用于需要具有对生物素的高结合亲和力的、稳定的(即抗蛋白酶)链霉亲和素的其他方法中。

以上概述不必然描述本发明所解决的所有问题。

发明内容