[发明专利]分辨至少两个光谱范围的高分辨率扫描显微术

说明书

出于高分辨率扫描显微术的目的，样品(2)由照明辐射(5)激发以发射荧光辐射，使得照明辐射(5)聚焦在样品(2)中或样品(2)上的点，以便于形成衍射受限照明斑(14)。以衍射受限方式将该点成像在检测器(19)上的衍射图像(17)中，其中检测器(19)具有检测器元件(25)和多个位置通道(21)，该位置通道(21)分辨衍射图像(17)的衍射结构。以具有小于照明斑(14)的一半直径的增量的多个扫描位置扫描样品(2)。从检测器(19)的数据和从与这些数据相关联的扫描位置产生样品(2)的图像，该样品(2)的图像具有增加超过图像的分辨率极限的分辨率。为了在至少两个预定光谱通道(R、G)之间区分样品(2)的荧光辐射，对于每个位置通道(21)存在通向分离元件(30)的独立的射束路径，该分离元件(30)在光谱上将这些射束路径分开到光谱通道(R、G)并且然后将不同位置通道的光谱通道(R、G)重新混合到附加独立射束路径(28)上的相同数量中，使得多个附加独立射束路径(28)接收不同光谱通道(R、G)中以及来自不同位置通道(21)的辐射，并且这些附加独立射束路径(28)中的每一个通向检测器元件(25)中的一个。

技术领域

本发明涉及样品的高分辨率扫描显微术的方法，其中由照明辐射激发该样品以发射荧光辐射，其中将该照明辐射聚焦到样品中或样品上的点以形成衍射受限照明斑，该点以衍射受限方式成像到空间分辨检测器装置(其具有分辨衍射图像的衍射结构的空间分辨率)上的衍射图像，该点相对于样品以小于照射斑直径的一半的增量位移到不同的扫描位置中，针对每个扫描位置从检测器装置读取强度数据，并且从该强度数据以及分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过用于成像该点的分辨率极限的分辨率。

本发明还涉及高分辨率扫描显微术的显微镜，其包括样品空间、光学单元、照明装置、成像装置、扫描装置、评估装置，该样品空间接收可被激发以发射荧光辐射的样品；该光学单元具有位于样品空间中的焦平面和分辨率极限；该照明装置具有供应照明辐射的入口并且采用照明辐射经由光学单元照明样品空间，使得光学单元将照明辐射聚焦到焦平面中的点以形成衍射受限照明斑；该成像装置用于经由光学单元将焦平面中点的衍射受限成像到检测器装置上的衍射图像，该检测器装置的检测区域位于与焦平面共轭的检测器平面，其中检测器装置具有分辨衍射图像的衍射结构的空间分辨率；该扫描装置用于将点以小于照明斑的一半直径的增量来位移到不同的扫描位置；该评估装置，用于从检测器装置读取强度数据并且用于从强度数据和分配到其的扫描位置来产生样品的图像，所述图像具有增加而超过分辨率极限的分辨率。

背景技术

用于检查生物制品的光学显微镜的一个经典应用领域是发光显微镜。这里，使用特定的染料(所谓的荧光体或荧光基团)来特定地标记例如细胞部分的样品。用代表激发辐射的照明辐射来照明样品，并且使用合适的检测器捕获由此已经激发的发光辐射。通过这种方式，可以在显微镜中表示单独的、不同颜色的细胞部分。当然也还可以使用不同的染料将制品的多个部分同时着色，所述染料特别地附着到制品的不同结构。这种方法被称为多发光。还可以测量自身发光的样品，即不加入染料。

如通常情况下，发光在这里被理解为磷光和荧光的涵盖性术语，即它涵盖了这两个过程。在提到荧光的情况下，这旨在以部分代表整体来理解而不是以限制的方式来理解。

为了检查样品，还已知使用激光扫描显微镜(也简称为LSM)，其使用共焦检测器装置(在这种情况下称为共焦LSM)，或非线性样品相互作用(称为多光子显微术)，以仅将位于物镜的焦平面中的平面成像。获得光学截面，并且在样品的不同深度处的多个光学截面的记录允许生成样品的三维图像，该样品的三维图像是由不同光学截面构成。激光扫描显微术因此适用于检查厚的制品。当然还可以使用发光显微术和激光扫描显微术的组合，其中使用LSM将发光样品成像在不同深度平面中。

原理上，光学显微镜的光学分辨率(包含LSM的光学分辨率)衍射受限于物理定律。这里术语“高分辨率”用于超过衍射极限的分辨率。

US 5043570描述了通过过采样来增加分辨率的尝试。在显微镜的衍射极限下，这不会导致显著增加的分辨率。