[发明专利]用于缀合抗体的转谷氨酰胺酶变体

说明书

转谷氨酰胺酶变体能够缀合不被来自茂原链霉菌的野生型转谷氨酰胺酶缀合的抗体。

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求在2015年10月2日提交的美国临时申请No.62/236274的权益，其公开内容通过提述并入本文。

序列表

通过提述将名称为“12610WOPCT_ST25”的序列表整体并入本文，其包括SEQ IDNO:1到SEQ ID NO:12，包括本文中公开的核酸和/或氨基酸序列。该序列表已经通过EFS-Web以ASCII文本格式一并提交，从而构成其纸件和计算机可读形式。该序列表最初在2015年9月24日使用PatentIn 3.5创建，大小约为25KB。

发明背景

抗体在医学和生物技术中有广泛应用。对于一些应用，希望将抗体与另一化学模块缀合，即，将抗体与这样的模块共价连接。所述模块可以是例如另一种蛋白质、放射性同位素、测定剂(例如，生物素或荧光标记)或药物。

已经公开了许多用于实现缀合的方法。转谷氨酰胺酶，特别是具有根据SEQ IDNO:1的氨基酸序列并在下文中称为BTG的来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)的细菌转谷氨酰胺酶，已经用于缀合抗体和其他蛋白质。

BTG可以在转酰胺反应中在第一蛋白质中的谷氨酰胺(胺受体)的甲酰胺侧链和第二蛋白质中的赖氨酸(胺供体)的ε-氨基之间形成酰胺键。在特异性方面，转谷氨酰胺酶对于谷氨酰胺残基具有选择性，要求它位于蛋白质环的柔性部分中，并且侧接特定的氨基酸。相反，BTG对于赖氨酸残基是宽容的：它甚至接受来自非蛋白质来源如亚烷基氨基化合物的氨基作为赖氨酸ε-氨基替代物。参见Fontana等人，2008。

IgG同种型的抗体具有多个谷氨酰胺——仅在重链恒定区中就具有九个或更多个，确切的数量取决于同种型。然而，在天然抗体中它们都不与BTG反应——即，它们不会转谷氨酰胺酶转酰胺基——因而对抗体进行一些修饰对于诱导反应性是必需的。通常，抗体在重链的天冬酰胺297(N297)处被糖基化(N-连接的糖基化)。Jeger在2009年和Jeger等人在2010年公开，通过N297A置换消除糖基化位点或使用诸如s PNGase F(肽-N-糖苷酶F)之类的酶进行翻译后酶促去糖基化使抗体去糖基化，可导致邻近的谷氨酰胺295(Q295)具有BTG反应性。(抗体恒定区中氨基酸位置的参考采用了按照EU索引的编号，如在Kabat等人的“Sequences of proteins of immunological interest”，第5版，出版号91-3242，U.S.Dept.Health&Human Services,NIH，Bethesda,Md.,1991；以下简称“Kabat”中所给出)。他们进一步显示，N297Q取代不仅消除了糖基化，而且还在第297位引入了第二个谷氨酰胺残基，即胺受体。因此，简单的去糖基化在每个抗体中产生两个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链一个，位于Q295)，而N297Q取代产生四个BTG反应性谷氨酰胺残基(每条重链两个，位于Q295和Q297)。

BTG的谷氨酰胺选择性可通过改变其氨基酸序列加以调变。在对人生长激素(hGH)研究中，Norskov-Lauritsen等人在2009年发现，通过用其他碱性或酸性氨基酸取代多达三个碱性或酸性氨基酸残基，可以提高BTG对hGH中的Gln-40与Gln141相比的选择性。在对另一种生物，拉达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum)的研究中，Hu等人在2009年、2010a和2010b报道，该生物的转谷氨酰胺酶对Gln-141的选择性可以通过在某些位置修饰其氨基酸序列或通过向其N端添加残基得以提高。