[发明专利]提高重组蛋白的半乳糖含量的方法

说明书

本发明涉及一种用于提高哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的半乳糖含量的方法，其中在所述细胞的培养过程中，改变细胞培养物的pH并且补料包含核苷、过渡金属盐和/或糖的组合物。

发明领域

本发明涉及一种用于提高哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的半乳糖含量的方法，其中在所述细胞的培养过程中，改变所述细胞培养物的pH并且补料包含核苷、过渡金属盐和/或糖的组合物。

发明背景

在过去20年中，使用治疗抗体用于治疗不同的疾病，如炎性疾病和癌症，已经变得越来越重要，并且第一种生物类似药(biosimilar)抗体产品已经上市。

源自哺乳动物血清的天然产生的抗体在其恒定区糖基化，并且这种糖基化对于所述抗体的效应子功能是重要的，如抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。此外，真核细胞中产生的重组单克隆抗体显示出特定的糖基化模式。在生物类似药治疗抗体的研发中，也必须注意生物类似药抗体就糖基化而言与起源产品是相当的。

几个研究已经表明，重组抗体的半乳糖含量影响所述抗体的生物活性，如在补体依赖性细胞毒性(CDC)测试中所测量的(Gazzano-Santoro等(1997)J.Immunol.Meth.202:163；Boyd等(1995)Mol.Immunol.32:1311-1318；Jefferis(2009)Nature Reviews DrugDiscovery 8:226-234)。鉴于半乳糖基化对糖蛋白的活性和功效的作用，监测和控制糖蛋白组合物中的半乳糖基化水平是重要的。

现有技术公开了各种用于调节糖蛋白组合物的半乳糖基化特征的方法。

Gramer等(2011)Biotechnol.Bioeng.108(7):1591-1602公开了可以通过给产生所述抗体的细胞提供尿苷、氯化锰和半乳糖来调节抗体半乳糖基化。相似地，WO 2012/149197 A2提供了一种使用含有锰和/或半乳糖的细胞培养补充物来控制半乳糖基化的方法。

此外，EP2511293A1描述了一种通过pCO₂调节控制半乳糖基化的方法。

在Ivarsson等(2014)J.Biotechnol.188:88-96中，研究了包括pH和溶氧张力的单个和组合化学和机械应激参数对糖基化的影响。

WO 2014/170866 A2公开了一种通过在细胞培养方法过程中降低温度以及将pCO₂水平维持在特定范围中来提高重组蛋白的半乳糖含量的方法。

McCracken等(2014)Biotechnol.Prog.30(3):547-553报道了细胞培养基中的天冬酰胺和铵浓度对重组蛋白的半乳糖基化的影响。

尽管如此，仍然需要一种细胞培养方法，其能够精确控制蛋白质半乳糖基化，特别是在生物类似药产品的研发中，其中生物类似药产品的半乳糖水平应当与参照产品的相当。

发明概述

本发明人已经发现，将pH降低与向哺乳动物细胞补料(feed)尿苷、氯化锰和半乳糖进行组合，对重组产生的抗体的半乳糖基化的提高程度，高于补料尿苷、氯化锰和半乳糖但不降低pH的情况。

因此，本发明涉及一种用于提高哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的半乳糖含量的方法，所述方法包括：

a)在细胞培养基中，在第一pH，将用至少一个编码重组蛋白的重组核酸分子转化的哺乳动物细胞，培养第一时间段；

b)在不同于第一pH的第二pH，在所述细胞培养基中培养所述哺乳动物细胞第二时间段；和

c)向(b)的培养物补料包含至少两种以下成分的组合物：

(i)一种或多种核苷；