[发明专利]包含长效红细胞生成素的组成物

说明书

本发明提供含有长效红细胞生成素的组成物及其制备方法。更具体地提供了具有优异的生物可持续性和高纯度的EPO‑Fc融合蛋白质组成物，其中EPO‑Fc的唾液酸含量为17mol/mol或者更多，并且以100ng/mg或者更少的量包括宿主细胞衍生的蛋白质(HCP)杂质。

技术领域

本发明是关于一种包括长效红细胞生成素(erythropoietin)的医药组成物及其制备方法。

背景技术

包括165个氨基酸的红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白以促进骨髓内成红血细胞(erythroblast)的分化且产生红细胞。EPO最多于肾脏产生且已知亦少量于肝脏产生。例如，如于慢性肾衰竭(CRF)所示，肾脏功能的损失典型地引起EPO产生的下降以及因此造成相关红细胞的下降。业已发现EPO对于因CRF引起的贫血和因多元成因造成的其他贫血的治疗具有优异功效，以及具有如外科手术辅助的不同的造血功能。

一般而言，如EPO的多肽具有低稳定度且容易被蛋白质水解酶，亦即血液中的蛋白酶，所退化及分解，由此经由肾脏或肝脏容易地排除。因此，多肽有短的生物半衰期间(半衰期)。所以，为了维持含有多肽作为药学组成的蛋白质医药的血液浓度及效价，该蛋白质医药需要经常投药给患者。然而，在该欲投药的蛋白质医药为注射调配物类型的情况中，经常注射以保持活性多肽的血液浓度通常可能引起患者疼痛。

为了增加EPO多肽的半衰期，目前已开发使用免疫球蛋白(Ig)所制备的融合蛋白质。Ig是血液的重要构造性组成。人类Ig(hIg)可包括多种类别如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

免疫球蛋白含有四个多肽链，且更具体而言，两个重链和两个轻链，其中这些链经由双硫键一起组合以形成四聚体。各链由变异区和恒定区所组成。重链的恒定区(重链恒定区)根据其同型(isotype)可再分为三或四个区段(site)如CH1、CH2、CH3和CH4。重链恒定区的Fc区依Ig的同型可包括铰链(hinge)、CH2、CH3和/或CH4功能域(domain)。

关于半衰期，融合于免疫球蛋白的Fc区域的嵌合蛋白质已知显示增加稳定性与延长的血清半衰期。

再者，已知黏附唾液酸至EPO蛋白质的表面可于肝脏中诱发蛋白质降解的预防。唾液酸于去唾液酸糖蛋白受体中保护第二个半乳糖基而因此影响活体中的EPO活性(生物活性)。已知存在于红细胞生成素的糖链的唾液酸在红细胞生成素半衰期的延长扮演重要角色，最终地，影响其功效。再者，由于已发现红细胞生成素的生物活性通过唾液酸酶的反应而失活，更活跃地进行唾液酸对红细胞生成素生物活性的功能的研究。在多数情况下，使用于治疗剂制造中的糖在表现糖蛋白的本质功效上具有基础及不可少的角色。尤其是，对于人衍生的红细胞生成素，糖的角色是绝对需要的。换言之，假如不包括糖，红细胞生成素不显示活性，根据糖的结构组成或于末端的唾液酸的含量，EPO的生物活性显著地受到影响。

宿主细胞表达期间，EPO-Fc中的唾液酸含量可通过添加N-乙酰基甘露糖胺至培养溶液而增加。上述过程后所得到的EPO-Fc通常是高唾液酸含量的EPO-Fc和低唾液酸含量的EPO-Fc的混合物。在此，已知高唾液酸含量的EPO-Fc较低唾液酸含量的EPO-Fc具有较长的半衰期。因此，有需要开发出选择性地制造具有增加的唾液酸含量的EPO-Fc的技术。

EPO-Fc制造时，需要培养经转化的宿主细胞，表达大量的EPO-Fc，崩解细胞以及纯化EPO-Fc。因此，对于大量生产高品质EPO-Fc，最适化培养和纯化技术为非常重要。于目前已开发的培养和纯化技术仍有大的改良空间，因此，迫切需要的是经由开发上述技术以最适化EPO-Fc制备过程。韩国专利公告案号897938(2009年5月8日登录)揭露免疫球蛋白融合蛋白质。

[现有技术文献]

韩国专利登录号0897938(2009.5.8)

发明内容