[发明专利]肿瘤的判定方法

说明书

本发明提供肿瘤的判定方法。一种包括以下工序的肿瘤的判定方法：1)将由受检组织或细胞制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐处理的工序(该受检组织或细胞来自罹患肿瘤并且(i)该肿瘤在MSI检查中被判定为MSI‑H、和/或该肿瘤在免疫组织化学检查中被判定为MLH1的表达消失或降低且(ii)通过遗传学检查被判定为在MLH1没有发现变异的患者)；2)从该亚硫酸氢盐处理DNA中将包含MLH1启动子区域的一部分或全部的DNA进行PCR扩增的工序；3)将该PCR扩增产物供于离子交换色谱，获得检测信号的工序；4)判定该检测信号的峰是否为表示高甲基化DNA的峰的工序；5)该峰被判定为表示高甲基化DNA的峰的情况下，将该肿瘤判定为来自非林奇综合征的患者的肿瘤的工序。

技术领域

本发明涉及利用基于离子交换色谱的甲基化DNA检测来判定肿瘤的方法。

背景技术

近年来，清楚地知道了DNA的异常甲基化深度参与癌化，受到了关注。作为肿瘤中的特征性表观遗传异常，已知有部分的基因启动子区域中的CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)二碱基序列高频出现的区域，大多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过使抑癌基因失活等而参与癌变。在大肠癌、胃癌等中，已经报告了与临床病理学因素相关的CpG岛的DNA甲基化亢进(非专利文献1～4)。

作为已经确立的甲基化DNA的分析方法，有利用亚硫酸氢盐(重亚硫酸盐、酸性亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法在甲基化DNA的分析中是最常用的方法。如果用亚硫酸氢盐处理单链DNA，则胞嘧啶经过磺化、水解脱氨化、脱磺化而转变成尿嘧啶。另一方面，由于被甲基化的胞嘧啶最初发生的磺化的反应速度极其缓慢，所以在实际进行的亚硫酸氢盐处理的反应时间中仍保持为甲基化胞嘧啶。因此，如果使用经亚硫酸氢盐处理过的DNA进行PCR(Polymerase Chain Reaction：聚合酶链式反应)，则甲基化胞嘧啶仍保持为胞嘧啶，但非甲基化胞嘧啶被从尿嘧啶替换成胸腺嘧啶而扩增。利用该PCR扩增产物的序列中产生的胞嘧啶和胸腺嘧啶这样的碱基的差异来分析甲基化状态。以此为基本原理通用的方法有专利文献1、非专利文献5中记载的Methylation-Specific PCR(MSP)法、以及非专利文献6、7中记载的Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)法。MSP法和COBRA法从无需特别的装置就能够进行甲基化DNA的定量分析这点来看现在仍是广泛使用的甲基化DNA分析方法，但从分析中利用电泳法这点和COBRA法中还需要限制性内切酶处理这点来看存在耗费精力和时间这样的课题。

作为其它的甲基化DNA分析方法，有焦磷酸测序(非专利文献8、9)。在该方法中，将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于焦磷酸测序，检测替换成胸腺嘧啶的甲基化胞嘧啶。但是，由于焦磷酸测序是需要专用测序仪的逐个读取碱基的方法，所以存在分析耗费时间以及需要昂贵的试剂这样的课题。

最近，提出了通过将经亚硫酸氢盐处理过的DNA的PCR扩增产物供于离子交换色谱，基于该色谱的检测信号的保留时间判定DNA的甲基化率的方法(专利文献2)。该方法与以往的利用电泳、焦磷酸测序的甲基化DNA分析方法相比，具有分析时间大幅缩短这样的优点。另外，提出了采用专利文献2的方法判定肾细胞癌的预后的方法(专利文献3)。