[发明专利]用于分析样品以检测布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的存在的方法以及用于实施该方法的试剂盒

说明书

本发明涉及用于分析样品、特别是液体样品如葡萄酒以便检测布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的可能存在的方法。该方法包括确定在样品中是否发现属于三倍体酿酒学酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的检测步骤，以及如果检测到这样的酵母，则推断该样品包含布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母。

本发明涉及用于分析样品、特别是葡萄酒样品中布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)物种的亚硫酸盐/酯(sulfite)抗性酵母的可能存在的方法，以及用于实施该方法的试剂盒。本发明还涉及能够扩增属于酿酒学三倍体(oenologiques)酵母遗传群的布鲁塞尔酒香酵母物种酵母特异性的核苷酸序列的引物对用于分析样品中布鲁塞尔酒香酵母物种的亚硫酸盐/酯抗性酵母的可能存在的用途。

布鲁塞尔酒香酵母(也称为布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis))物种酵母代表了一类酿造饮料(如葡萄酒、啤酒、苹果酒等)主要的改变来源，并且更特别地是葡萄酒污染的首要原因。这些酵母产生特别大量的挥发性酚类，使葡萄酒具有令人不快的味道和气味，目前用术语“马厩气味”或“马汗”来形容。这种污染可导致重大经济损失，特别是当其影响在木桶中陈化的红葡萄酒时。由布鲁塞尔酒香酵母引起的改变确实影响了差不多25％的红葡萄酒，并导致消费者对葡萄酒的准系统拒绝(rejet quasi-systématique)。

负责葡萄酒生产的人员目前采取了多种方法用来对付由布鲁塞尔酒香酵母引起的葡萄酒改变。

在这些方法中， 可以提到通过软件(例如在Bret’和 Brett名下销售的那些)来预测葡萄酒中这些酵母的存在的方法，其根据未发酵葡萄汁和葡萄酒的组成以及葡萄酒制作地应用的酿酒实践来评估给定葡萄酒的污染风险； 用于检测这些酵母的存在的定量和半定量方法，尤其是通过在选择性培养基中传播该物种、聚合酶链式反应或流式细胞术，特别地是半定量工具Brett， 其允许测定样品中布鲁塞尔酒香酵母群体的水平；或者还有以去除产生的挥发性酚类为目的的补救方法，例如通过吸附剂如酵母片、活性炭等。然而，这些方法中没有一种被证明是真正令人满意的。例如，补救方法一般对经处理葡萄酒具有感官上的影响。

另一种目前实施来防止葡萄酒中布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的存在的方法是对抗这些酵母的方法。其中，可以提到过滤、壳聚糖处理等。然而，这些方法具有实施复杂和需要昂贵投资的缺点，并且其往往会对葡萄酒的感官质量产生负面影响。

由于对实施的限制较小，用于对抗布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的最广泛的方法是被称为亚硫酸化(sulfitage)的方法，其在于在葡萄酒中加入二氧化硫，以特别地利用硫的抗氧化剂和抗微生物剂性能。然而，当葡萄酒中存在的布鲁塞尔酒香酵母菌株对亚硫酸盐/酯具有抗性时，这种方法被证明是无效的。如Curtin等，2012，在Letters in AppliedMicrobiology，55：56-61出版物中所特别描述的，现有技术确实显示，在布鲁塞尔酒香酵母物种的情况下，亚硫酸盐/酯抗性的表型特征取决于菌株。

此外，亚硫酸化方法的实施也被证明具有风险，因为在高剂量下系统地使用二氧化硫促使新的抗亚硫酸盐/酯菌株出现。例如，在前述Curtin等，2012的出版物中报道了在澳大利亚，为了对抗布鲁塞尔酒香酵母而集中使用亚硫酸化约十年之后，目前85％的分离菌是亚硫酸盐/酯抗性的。而且，近年来，一般农业政策的目的是减少投入。在酿酒学中，这导致与越来越多的限制性立法有关的减少使用的亚硫酸盐/酯的剂量的强的社会压力。

因此，目前需要这样的方法，其允许理由充分地实施使用亚硫酸盐/酯用于葡萄酒亚硫酸化的策略，即仅针对含有对亚硫酸盐/酯敏感的布鲁塞尔酒香酵母的葡萄酒来使用，对于所述葡萄酒亚硫酸化是有用的。

为了提出这样的方法，现有技术已经进行了多种研究以试图建立布鲁塞尔酒香酵母物种酵母的基因型与其表型特征、更特别地其抵抗磷酸盐/酯的能力之间的关系。例如，前述Curtin等，2012的出版物中所述的研究就是如此，该研究的目的是在许多布鲁塞尔酒香酵母分离菌的基础上鉴定这些酵母的亚硫酸盐/酯抗性表型与基因型标志物之间的潜在关系。