[发明专利]使用AOBGL3同源体的甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法

说明书

本发明在于提供一种甜菊醇糖苷及/或甜菊醇的制备方法，其包括使糖苷酶AOBGL1及/或AOBGL3或其突变体与具有至少1个单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的甜菊醇糖苷反应，从而剪切所述单葡萄糖苷键及/或单葡萄糖基酯键的工序。

技术领域

本发明涉及甜菊醇糖苷及甜菊醇的制造方法。

背景技术

在菊科甜菊(Stevia rebaudiana)的叶中包含二萜的一种的被称作甜菊醇(Steviol)的次级代谢产物，在甜菊醇上附加了糖的甜菊醇糖苷中呈现砂糖的约300倍的甜味，它们作为低热量的甜味剂在食品产业中被利用。肥胖作为深刻的社会问题在国际上日益严峻，从增进健康及削减医疗费的观点出发低热量甜味剂的需求也日益增大。目前，人工合成的氨基酸衍生物阿斯巴甜(Aspartame)、乙酰磺胺酸钾(Acesulfame Potassium)作为人工甜味剂被利用，而像甜菊醇糖苷这样天然存在的低热量甜味剂更为安全，从而可期待能够更容易得到消费者理解(Public Acceptance)。

甜菊醇糖苷中的甜菊苷为在甜菊醇上附加了3个葡萄糖的化合物，一般在甜菊的叶中包含最多。甜菊苷具有蔗糖的大约300倍的甜味度但呈现些许苦味。甜菊醇糖苷的瑞鲍迪甙A为在甜菊醇上附加了4个葡萄糖的化合物，具有蔗糖的大约400倍的甜味度。甜菊苷与瑞鲍迪甙A为甜菊甜味的核心物质。另外，还已知有在甜菊醇上附加了5个葡萄糖的瑞鲍迪甙D、附加了6个葡萄糖的瑞鲍迪甙M等糖苷。另外，已知甜茶中包含在甜菊醇的13位与19位分别各附加了1个葡萄糖的甜茶苷，其为甜茶主要的甜味成分。除此以外，已知存在认为是反应中间体的糖苷或根据糖的种类而不同的类似物(图1)。

另一方面，关于甜菊醇已知有认知功能的改善效果等。

在甜菊醇糖苷中，只要能够利用仅作用于特定的糖苷键的酶，则可生产特定的糖苷或除去不需要的糖苷，从而甜菊提取物味质的改善、特定的甜菊醇糖苷的纯化变得容易等的优点明显。

关于水解甜菊醇糖苷的酶活性，在几个生物种类中有报道。其中，关于曲霉属丝状菌生成甜菊醇糖苷水解酶，报道了在生酱油中具有将甜菊苷水解成甜茶苷的活性(非专利文献1)、在Pectinase酶制剂或Hesperidinase酶制剂、Taka diastase酶制剂中具有将甜菊苷水解成甜菊醇的活性(非专利文献2-4)。另外，报道了通过组合使用来自曲霉属丝状菌的果胶酶制剂与来自蜗牛(Helix pomati a)的酶制剂从而由甜菊苷制造甜菊醇的方法(专利文献1)。记载了在来自Asp ergillus aculeatus的酶制剂Viscozyme L(novozyme)中，具有水解成为甜菊苷→甜茶苷→甜菊醇单糖基酯的活性(非专利文献5)。另外，记载了在Aspergill us aculeatus的固体培养提取物中具有将甜菊苷转变为甜菊醇的活性(非专利文献6)。

如上所述，虽然提示了包含曲菌的曲霉属丝状菌存在具有甜菊醇糖苷水解活性的酶基因，但是并没有关于承担酶活性的基因或酶的报道。

另外，存在曲菌的AO090009000356基因所编码的糖苷水解酶(GH)3家族的β-糖苷酶水解具有β-糖苷键的二糖类的报道(非专利文献7)。具体而言，按照具有β-1,3键的昆布二糖、具有β-1,6键的β-龙胆二糖、具有β-1,4键的纤维二糖、具有β-1,2键的槐糖的顺序，水解的特异性高。然而，并没有报道是否具有水解以甜菊醇糖苷为代表的萜烯糖苷的活性。

在除此以外的生物中也报道了具有水解甜菊醇糖苷的活性。例如，公开了甲米菌属细菌具有分解甜茶苷的19位葡萄糖基酯键但无法分解13位糖苷键的酶(专利文献2)。另外，报道了来自Flavobacterium johnsoniae的β-糖苷酶具有分解甜菊醇糖苷的活性(水解13位β-糖苷键与19位葡萄糖基酯键的活性)。然而，虽然发现了它们中的任一个均具有水解甜菊醇糖苷的活性，但并没有鉴定出承担其活性的基因。

进而，在曲菌中认为存在很多编码具有β-糖苷酶样活性的GH3家族酶、GH5家族酶的基因，即使可检测酶活性，但鉴定哪个基因承担其活性并不容易。