[发明专利]用于以高效率从植物原生质体生成基因组工程改造的植物的方法

权利要求书

1.一种用于增加来自甘蓝原生质体的基因组编辑的甘蓝的生成效率的方法，其包括以下步骤：

(i)通过将其中预装配Cas蛋白和裸RNA形式的指导RNA的Cas蛋白-指导RNA核糖核蛋白引入分离的甘蓝原生质体中以编辑甘蓝原生质体的基因组，其中所述指导RNA包含选自SEQID NO:12至18的序列；和

(ii)通过经由从所述甘蓝原生质体形成愈伤组织且进一步培养该愈伤组织再生所述甘蓝原生质体为全甘蓝来生成基因组编辑的甘蓝，

其中引入至该基因组中的突变在再生过程中是稳定维持且积累的，其中所述基因组的编辑通过敲除进行。

2.权利要求1的方法，其中，所述指导RNA为包含crRNA和tracrRNA的双RNA的形式，或单链指导RNA的形式。

3.权利要求2的方法，其中，所述单链指导RNA包含crRNA的一部分和tracrRNA的一部分。

4.权利要求1的方法，其中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白或其中的起催化作用的天冬氨酸残基被另一氨基酸置换的Cas9蛋白的变体。

5.权利要求1的方法，其中，所述Cas蛋白识别NGG三核苷酸。

6.权利要求1的方法，其中，所述Cas蛋白与蛋白转导结构域连接。

7.权利要求4的方法，其中，所述氨基酸为丙氨酸。

8.权利要求1的方法，其中，所述Cas9蛋白源自链球菌属(Streptococcus)。

9.权利要求8的方法，其中，所述链球菌属为酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

10.权利要求1的方法，其中，所述引入通过选自下组的方法进行：微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖处理、脂质转染、纳米颗粒介导的转染、蛋白质转导结构域介导的转导和PEG介导的转染。