[发明专利]用于以高效率从植物原生质体生成基因组工程改造的植物的方法

说明书

本发明涉及一种通过使用Cas蛋白‑指导RNA核糖核蛋白(RNP)增加从植物原生质体再生的基因组修饰的植物的生成效率的方法。本发明的用于增加基因组修饰的植物的生成效率的方法可有效地生成具有突变的靶基因的植物，并且还可使外源DNA插入植物的情况最小化。因此，本发明可非常有用地用于多种领域，诸如农业、食品和生物技术领域。

技术领域

本发明涉及一种通过将Cas蛋白和指导RNA引入植物原生质体而增加从植物原生质体再生的基因组编辑的植物的生成效率的方法。

背景技术

尚不清楚基因组编辑的植物是否将受到欧盟及其他国家通过的遗传修饰生物(GMO)立法的监管(Jones,H.D.,Nature Plants,2015,1:14011)。分子剪刀(可编程核酸酶)对染色体靶位点诱导小的插入和缺失(插入/缺失)或置换，这与自然发生的遗传变异无法区分。这种基因组编辑的植物在某些国家可能被认为是GMO，阻碍了可编程核酸酶在植物生物技术和农业中的广泛使用。例如，当使用农杆菌属(Agrobacterium)时，由此生成的基因组编辑的植物具有外源DNA序列，包括基因组中编码的可编程核酸酶的基因。在无性繁殖植物诸如葡萄、马铃薯或香蕉中通过繁殖去除这些源自农杆菌的DNA序列是不可行的。

或者，可以将编码可编程核酸酶的非整合型质粒转染到植物细胞诸如原生质体中。然而，本发明的发明人注意到以下事实：转染的质粒在细胞中被内源性核酸酶降解，并且所得小DNA片段可以被插入Cas9中靶(on-target)和脱靶(off-target)位点，如人类细胞中所例举的(Kim,S,etc.,Genome research,2014,24:1012-1019)。

将预装配的Cas9蛋白-gRNA核糖核蛋白(RNP)而不是编码Cas9蛋白的质粒和gRNA,递送到植物细胞中可以避免将重组DNA插入宿主基因组的可能性。此外，如人类细胞中所示，RNA指导的工程改造的核酸酶(RGEN)RNP在转染后即刻切割染色体靶位点并且被细胞中的内源性蛋白酶迅速降解，具有在再生的全植株中减少镶嵌现象和脱靶效应的潜力。预装配的RGEN RNP可用于许多跨越植物物种，不使用事先密码子优化，以及使用不同的启动子以在每个物种中表达Cas9和gRNA。另外，RGEN RNP能够在体外预筛选以选择高活性gRNA以及经由限制性片段长度多态性(RFLP)分析突变克隆的基因分型。然而，尚未有报道表明RGEN RNP以保证基因组编辑的效果被引入植物原生质体，并且从原生质体成功再生植物。

发明内容

技术问题

本发明的发明人已经做出广泛的努力以开发能够通过将Cas蛋白-gRNA RNP应用于植物来编辑植物的基因组的本发明的技术。发现了可通过将Cas蛋白和指导RNA引入分离的植物原生质体来编辑植物原生质体的基因组并再生植物原生质体来高效率生成基因组编辑的植物，由此完成本发明。

技术方案

本公开提供了一种用于增加来自植物原生质体的基因组编辑的植物的生成效率的方法，其包括以下步骤：(i)通过将Cas蛋白和指导RNA引入分离的植物原生质体中编辑植物原生质体的基因组；和(ii)通过再生植物原生质体生成基因组编辑的植物。

本发明的另一方面是提供一种通过上述方法生成的从基因组编辑的植物原生质体再生的植物。

本发明的又一方面是提供一种用于增加来自植物原生质体的基因组编辑的植物的生成效率的组合物，其包含Cas蛋白和对于编码靶基因的DNA具有特异性的指导RNA。

有益效果

根据本发明的各方面，增加基因编辑的植物的生成效率的方法使有效生成靶基因突变的植物和将外源DNA插入到植物中的情况最小化成为可能。因此，根据实例，本发明可非常有利地用于很多个领域，其包括农业、食品和生物技术。

附图说明