[发明专利]等位基因选择性基因编辑及其用途

说明书

本发明涵盖用于引导CRISPR基因编辑的治疗导向分子的化合物、结构、组合物和方法。用于引导基因编辑的导向分子可以是等位基因选择性的或疾病等位基因选择性的，并且可以表现出降低的脱靶活性。导向分子可以包括单体，所述单体包括UNA单体、核酸单体和修饰的核苷酸，其中所述化合物靶向于基因组DNA。本发明的导向分子可以用作体外、离体或体内编辑或破坏基因的活性成分。

技术领域

本发明涉及用于编辑基因和调节基因表达的生物药物和治疗剂领域。更具体地说，本发明涉及用于编辑或改变多核苷酸(包括基因组多核苷酸)并最终用于体内基因编辑和调节、破坏、激活或抑制基因表达的方法和组合物。

序列表

本申请包括作为名为ARC5237WO_SL.txt的ASCII文件以电子方式提交的序列表。

背景技术

对预定位点特异性的基因编辑可以用靶标导向型核酸酶Cas9和多核苷酸修复方法完成。使用靶标导向型Cas9内切核酸酶，可以在靶位点附近切割双链DNA的两条链以产生双链断裂。

Cas9的靶标特异性由导向分子决定，所述导向分子使Cas9与多核苷酸靶标复合。典型地为17-20个碱基长度的多核苷酸靶序列必须侧接3′原型间隔区相邻基序(protospacer-adjacent motif；PAM)。PAM的结构由衍生Cas9的细菌物种决定。偶然地，在大多数物种中的大多数感兴趣的基因中可以找到含有PAM的合适靶序列。在一个变体中，导向分子可以制成单RNA链，其具有与靶标互补的序列，该导向分子连接于与Cas9复合的、由细菌衍生的crispr-tracr RNA序列。

在某些模式中，在dsDNA的特定位点形成双链断裂后，可以修复断裂以实现DNA的编辑。双链断裂可以通过非同源末端接合(NHEJ)来修复，以产生随机插入和缺失。双链断裂还可以使用外源DNA模板通过同源介导的修复(HDR)来修复，以产生受控的插入、缺失和取代。

用Cas9进行基因编辑的主要缺点是导向分子对靶多核苷酸的效力可能有限。导向分子的特异性和活性可能是不可预测的。用于Cas9编辑的导向分子可以在效力方面变化很大，并且一些原本遵循结构方案的导向物可能是无效的。

用Cas9进行基因编辑的另一个缺点是导向分子可能缺乏对靶等位基因的选择性。基因组变异可能促进疾病状况。一些与疾病表型相关的等位基因已经在医学遗传学中被确认。无法靶向特定等位基因是当前基因编辑方法的显著缺点。

用CRISPR-Cas系统进行基因编辑的其他缺点包括脱靶突变的发生。

需要用于基因编辑的稳定且有效的导向分子，以及用于治疗疾病的组合物和方法。

迫切需要用于通过Cas9引导基因编辑的新分子，以及具有等位基因选择性和降低的脱靶活性的新分子。

发明内容

本发明提供了对CRISPR基因编辑可以是高度有效的导向分子。本发明的组合物和方法可用于体内、离体和体外的基因编辑。

本发明进一步考虑用通过新颖的等位基因选择性导向分子引导的Cas酶进行基因编辑的方法。在一些实施方案中，本发明的导向分子可用于与CRISPR-Cas系统一起进行基因编辑，其中脱靶突变的发生有所减少。

使用Cas9，本发明的导向分子可以提供有效的基因编辑。本发明的导向分子对于基因编辑可以是有效的，以基于一种或多种核苷酸多态性在等位基因变异之间进行选择。本公开的导向分子的另外的优点包括减少的脱靶效应。

在一些实施方案中，对于靶向基因组DNA并通过CRISPR/Cas基因编辑产生双链断裂，本发明的导向分子可表现出非凡的、令人惊讶的等位基因选择性水平。在某些实施方案中，本发明的导向分子可以提供降低的脱靶活性和更高的基因编辑效率。