[发明专利]用于改进的蛋白质分离的相反的pH-盐梯度

说明书

本发明涉及用于从其相关的电荷变体（例如酸性与碱性单体）、糖基化变体和/或可溶性尺寸变体（例如聚集体、单体、2/3片段、¾片段、抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)）中改进的制备分离蛋白质，特别是单克隆抗体（mAB）的方法。

本发明涉及用于从其相关的电荷变体（例如酸性与碱性单体）、糖基化变体和/或可溶性尺寸变体（例如聚集体、单体、2/3片段、抗原结合片段(Fab)和可结晶片段(Fc)）中改进的制备分离蛋白质，特别是单克隆抗体（mAB）的方法。

发明背景

蛋白质异质性因体内翻译后修饰而产生，或经由化学和酶促反应人工产生，或因机械应力、高温或极端pH作为发酵和纯化过程中的副产物产生[1-4]。与mAb相关的蛋白质异质性包括但不限于电荷变体（如酸性和碱性变体）、糖基化变体和尺寸变体（如聚集体、单体、片段、Fab和Fc残基）[5-7]。在治疗性mAb中，此类产物变体导致不同的药代动力学和药效动力学，这将影响药物的稳定性、功效和效力[1]。因此，它们必须被彻底剖析并从最终产品池中除去。

液相色谱法（LC）用作mAb生产的标准纯化工具[8]。用于mAb的通用下游工艺（DSP）包括但不限于A蛋白亲和色谱法（AC）、离子交换色谱法和疏水作用色谱法（HIC）[9]。IEC（离子交换色谱法）如强阳离子交换色谱法（SCX）、弱阳离子交换色谱法（WCX）和弱阴离子交换色谱法（WAX）以分析规模广泛使用以分离具有非常相似的等电点（pI）的mAb电荷变体与其它蛋白变体，其包括但不限于尺寸变体、糖基化变体、唾液酸化（sialylation）变体和C-端/N-端加工变体[7、10-14]。虽然使用具有固定pH值的氯化钠的浅盐梯度斜率可用于表征mAb变体，其在电荷变体分离中的应用是蛋白特异性的，并必须针对个别mAb进行优化[15]。色谱聚焦（CF）是盐梯度的替代，其中使用聚两性电解质缓冲剂在该柱内部[16-21]或通过在该柱入口处混合两种具有不同pH值的适当的缓冲剂（其随后流通穿过该柱）在外部[22-26]生成pH梯度。取决于相应的pI值，mAb电荷变体在pH梯度中的不同点处聚焦，并因此导致高分辨的峰[27]。

高性能CF在IEC中用于mAb电荷变体分离的初始应用限于具有7.3至9.0的pI范围的中性与碱性mAb[28-29]。近来发现，这种应用谱系可以通过调节pH梯度中的离子强度扩展至酸性mAb（pI = 6.2）[29]。据报道[29]，在提高和受控的离子强度下的pH梯度已经对酸性、中性和碱性获得更好解析的峰。虽然上述实例描述了分析规模下盐介导的pH梯度对mAb电荷变体分离的成功，Kaltenbrunner等人[30]在更早时已经声称他们的使用甘露醇、硼酸盐和氯化钠的pH-盐混合梯度能够在制备规模上分离mAb同种型。他们已经使用由pH 7.0至9.1的递增pH梯度结合递减的盐梯度来分离具有8.15至8.70的pI的同工蛋白质。

但是，在他们的方法中发现了一些限制、缺点和矛盾。例如，他们建议的方法仅适于分离糖蛋白同种型，其在多个碳水化合物侧链方面不同[29-30]。这限制了此类梯度体系的使用仅限于糖基化蛋白质，由此令其对其它类型的mAb变体如电荷或尺寸同种型而言不切实际。尽管其声称提高的峰间分辨率归因于pH-盐混合梯度，在含有顺式二醇的寡糖与缓冲剂组分硼酸盐之间的非特异性反应是否对所述改进的分离具有显著影响还不清楚[29]。此外，它们的所谓同工蛋白质的“制备”分离仅为0.5毫克mAb/毫升填充树脂[30]，这对生产规模分离仍然太低。