[发明专利]确定体内相互作用模式的方法

说明书

本文报道了用于确定与具有至少两个特异性结合抗原的结合位点的人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用的方法，其包括以下步骤：1)确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，和2)在足以将抗体切割成Fab和Fc区的条件和时间下，温育包含抗体和衍生自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸‑牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物，并确定抗体的Fabs对多聚体的结合亲和力，由此如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则抗体对多聚体抗原的结合亲和力是亲和力驱动的，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则抗体对多聚体抗原的结合亲和力是亲合力驱动的。

本发明属于免疫测定领域。尤其是本文报道了一种用于选择结合测定的方法，该测定适当地反映了治疗性结合剂(药物)对其各靶标的相互作用模式(即亲和力或亲合力)。这与选择反映治疗性结合剂(药物)结合强度的结合测定相关。

发明背景

生物制药产品的质量除了其作用之外具有决定性的重要性。因此，除了对作用模式进行详细研究之外，确定基于蛋白质的药物的身份、纯度和活性以便将其安全地用作治疗剂是绝对必要的。

单克隆抗体(mAb)可以借助各种分离和测试技术成功分析。

木瓜蛋白酶，作为一种半胱氨酸蛋白酶，在精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)之后相对非特异性地切割肽键。如果温育时间足够长，木瓜蛋白酶消化导致完全水解。然而，通过有限的蛋白水解，抗体可以在其铰链区中相对选择性地被切割(Lottspeich，F和Engels，J.W.，“Bioanalytik Spektrum AkademischerVerlag”Munich第2版(2006)201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的N端侧上。在该过程中保留二硫键，从而在消化后获得三个片段(2个Fab片段，1个Fc片段)。两个N-末端片段被称为抗原结合片段(Fab、抗原结合片段)，C-末端片段被称为结晶片段(Fc、结晶片段)。每个Fab片段由完整轻链和重链的氨基末端那半组成。Fc片段由仍然通过二硫桥连接在一起的重链的两个羧基末端部分组成。

近年来，已经鉴定出不同的IgG特异性蛋白酶。

在WO 2015/40125中报道了链球菌红疹毒素B(SpeB)。它被描述为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的半胱氨酸蛋白酶，显示出将IgG在铰链区中切割成两个稳定的单体Fab片段和一个Fc片段。进一步报道SpeB在根据Kabat编号系统的位置238和239(根据EU编号系统的位置225和226)之间切割IgG的铰链区。

来自人类病原体酿脓链球菌的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降解酶S)(也称为Mac-1或sib-38)是特异性切割免疫球蛋白G型(IgG)抗体重链的半胱氨酸蛋白酶。IgG是迄今为止唯一已知的IdeS底物(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。IdeS由339个氨基酸组成，包括包含29个氨基酸的信号肽(von Pawel-Rammingen，U.等人，EMBO J.21(2002)1607-1615)，其中RGD基序由氨基酸214至216形成。IdeS在包含在识别序列LLGGP中的根据Kabat编号系统的位置249和250(根据EU编号系统的位置236和237)(Gly-Gly)之间的铰链区切割人IgG(G类免疫球蛋白)。人类IgG2在识别基序PVAGP中的氨基酸丙氨酸和甘氨酸之间被切割。IgG2a和IgG3型的鼠抗体也被切割(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。

牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是进行性牙周病的主要致病因子(参见例如Kadowaki，T.等人，J.Biol.Chem.269(1994)21371-21378)。由此分离出不同的酶，其中包括牙龈菌蛋白酶、胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。

Kikuchi，Y.等人报道了通过使用表面等离振子共振测定抗体片段的浓度和结合亲和力(J.Biosci.Bioeng.100，(2005)311-317)。