[发明专利]在具有降低的CLR1活性的丝状真菌中生产蛋白质的方法

说明书

本发明涉及在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性并表达所述重组多肽。该方法还涉及经遗传修饰以降低或消除CLR1活性的丝状真菌嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，以及该丝状真菌在生产重组多肽中的用途。

发明领域

本发明涉及在丝状真菌中生产重组多肽的方法，所述丝状真菌经遗传修饰以降低或消除纤维素酶调节物1(CLR1)的活性并表达所述重组多肽。该方法还涉及经降低或消除CLR1活性的遗传修饰的丝状真菌嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，以及该丝状真菌在生产重组多肽中的用途。

发明背景

已显示丝状真菌是用于生产多种蛋白质的优异宿主。真菌菌株如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)和毁丝霉属(Myceliophthora)已被应用于大范围的酶的工业生产，因为它们可以将大量蛋白质分泌入发酵肉汤中。这些真菌的蛋白质分泌能力使它们成为特定酶或酶混合物靶向生产的优选宿主。然而，通常，这些宿主分泌许多不同酶的混合物，使得粗蛋白质产物不明确并且对于目的蛋白质需要复杂的纯化方案。即使在编码目标酶的基因通过遗传修饰过度表达的情况下，目标酶也只构成总分泌蛋白的一小部分。

因此，非常需要提供一种真菌生产系统，其能够分泌大量的特定酶而不存在高水平的其他蛋白质。

这样的生产系统将能够生产相对纯的酶和简化的大规模纯化所需的酶。所产生的酶可以用于不同的应用，例如，用于食品和饲料应用、洗涤剂或家庭护理以及植物生物质水解(生物燃料和化学品)、纺织品整理以及造纸和纸浆工业。

WO2010/107303A2描述了嗜热毁丝霉菌株的UV诱导的诱变，这导致产生少量内源性纤维素酶和蛋白酶的分离物。Visser等人(2011)Industrial Biotechnology 7(3)：214-223公开了称为LC(低纤维素酶)菌株的嗜热毁丝霉菌株，所述菌株几乎丧失了其全部产生纤维素酶的能力。

然而，仍然需要一种用于在丝状真菌中生产重组多肽的有效方法。

发明目的和概述

这个需求由本发明解决。本发明人出人意料地发现丝状真菌如嗜热毁丝霉中纤维素酶调节物1(CLR1)活性的降低导致具有产生增加纯度的重组多肽的能力的菌株。

因此，一方面，本发明提供了一种在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除了CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中该重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：

(i)在不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其纤维素衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和

(ii)从培养基中分离重组多肽。

另一方面，本发明提供了一种在丝状真菌中生产重组多肽的方法，该丝状真菌被遗传修饰以与不具有该遗传修饰且与被遗传修饰的丝状真菌在相同条件下培养的丝状真菌相比降低或消除CLR1的活性，并且该丝状真菌被进一步遗传修饰以表达所述重组多肽，其中该重组多肽在不能被CLR1活化的启动子的控制下表达，所述方法包括：

(i)在不含有能够诱导CLR1活性的纤维素或其纤维素衍生物的培养基中生长所述经遗传修饰的丝状真菌；和

(ii)从培养基中分离重组多肽。

丝状真菌可以是嗜热毁丝霉菌。