[发明专利]用于将片段化的核酸连接在一起的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于将片段化的核酸连接在一起的均匀方法，所述方法包括下述步骤：

-执行扩增步骤，该扩增步骤包括使疑似包含片段化的靶核酸的样品与以下物质接触：

-一对外部引物，其包含第一核酸序列和第二核酸序列，如果任何靶核酸存在于所述样品中，则产生包含第一有义链和第一反义链的第一扩增产物；和

-一对彼此互补的内部引物，其包含第三核酸序列和第四核酸序列，所述第三核酸序列被构造成与所述第一扩增产物的第一反义链杂交以产生第二扩增产物的第二有义链，且所述第四核酸序列被构造成与所述第一扩增产物的第一有义链杂交以产生所述第二扩增产物的第二反义链；和

-如下产生全长靶核酸：

-使所述第一有义链的第一个3’末端区域与所述第一反义链的第二个3’末端区域退火，其中所述第一有义链的第一个3’末端区域引发所述第一有义链在所述第一反义链上面的延伸，且所述第一反义链的第二个3’末端区域引发所述第一反义链在所述第一有义链上面的延伸，

其中所有步骤都以均匀方式执行。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

-执行杂交步骤，其包括使全长扩增产物与一种或多种可检测探针接触；和

-检测所述全长扩增产物的存在或不存在，其中所述全长扩增产物的存在指示所述靶核酸在所述样品中的存在，且其中所述全长扩增产物的不存在指示所述靶核酸在所述样品中的不存在。

3.根据权利要求2所述的方法，其中：

-所述杂交步骤包括使所述全长扩增产物与包含第五核酸序列的一种或多种可检测探针之一接触，所述第五核酸序列用供体荧光部分和对应的受体部分标记；和

-所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述靶核酸在所述样品中的存在或不存在。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。

5.根据权利要求2-3中的任一项所述的方法，其中所述供体荧光部分和对应的受体部分是在所述探针上彼此的不超过8个核苷酸内。

6.根据权利要求3中的任一项所述的方法，其中所述受体部分是猝灭剂。

7.根据权利要求2中的任一项所述的方法，其中所述杂交步骤包括使所述全长扩增产物与一种或多种可检测探针之一接触，所述可检测探针包含含有双链DNA结合染料的分子探针，所述双链DNA结合染料在与所述全长扩增产物的双链核酸相互作用后发射荧光信号；和

所述检测步骤包括通过解链曲线分析来检测荧光共振的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述靶核酸在所述样品中的存在或不存在。

8.根据权利要求1-3、6和7中的任一项所述的方法，其中彼此互补的内部引物对的相对浓度等于或低于外部引物对的浓度。

9.根据权利要求1-3、6和7中的任一项所述的方法，其中所述扩增步骤进一步包括使所述疑似包含片段化的靶核酸的样品与第二对彼此互补的内部引物接触。

10.根据权利要求1-3、6和7中的任一项所述的方法，其中所述疑似包含片段化的靶核酸的样品是生物样品。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物样品选自呼吸道样本、粪便样本、血液样本、皮肤拭子、鼻拭子、创伤拭子、血液培养物、皮肤或软组织感染物。

12.根据权利要求1-3、6和7中的任一项所述的方法，其中所述疑似包含片段化的靶核酸的样品是临床样品。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述临床样品选自福尔马林固定的和石蜡包埋的组织或血浆。