[发明专利]用于将片段化的核酸连接在一起的方法和试剂盒

说明书

提供了用于将片段化的核酸序列连接在一起的方法和试剂盒，其包括执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使疑似包括片段化的靶核酸的样品与一对外部引物和一对自互补的内部引物接触，和产生全长靶核酸。所述方法可以包括执行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了试剂盒，其被设计成用于检测靶核酸序列。

技术领域

本发明涉及核酸扩增的领域，且具体地，涉及连接片段化的核酸碎片。

背景技术

因为甲醛（福尔马林的有效组分）导致核酸和蛋白之间的交联的产生，并因为固定工艺条件(例如，极低的pH)另外造成核酸片段化，从福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)组织提取DNA仍然是一项挑战(Lin等人, Anal Biochem., 395(2): 265-267 (2009))。此外，人血液中循环的无细胞DNA (cfDNA)和RNA的检测（就其在所谓的液体活组织检查方案中的应用而言，其已经产生了大量兴趣）具有某些限制，包括这样的DNA的片段化性质，其中平均大小为约160-180 bp(Suzuki等人, Clinica Chimica Acta, 387, 55-58 (2008))。

对于基于PCR的癌症诊断测定，片段化的DNA的大小限制对于突变热点如BRAFV600、KRAS G12/G13或PIK3CA E542/E545/E546（其中突变簇集在少数附近密码子中）而言可能不是问题，但是它对于其它如EGFR外显子20（其中突变跨越25个密码子）而言是挑战。任何样品中完整DNA的丰度对于多个突变位点的准确且灵敏检测而言也可能是不足够的，所以在突变检测之前的靶标预富集方法是合乎需要的。靶核酸的预富集方法是已知的，但是这些方法包括多个试剂添加步骤，或者是靶标链的线性扩增方法。本发明以指数和均匀方式实现了这样的靶标预富集方法，不需要多个分散的步骤和试剂。因此，可以使重叠的短核酸片段连在一起并因而充当下游PCR检测的模板的方法是合乎需要的，本发明解决了这一点。

发明内容

在一个方面，提供了一种用于将片段化的核酸连接在一起的方法，所述方法包括执行扩增步骤，所述扩增步骤包括使疑似包括片段化的靶核酸的样品与以下物质接触：一对外部引物，其包括第一核酸序列和第二核酸序列，如果任何靶核酸存在于所述样品中，则产生包括第一有义链和第一反义链的第一扩增产物；和一对自互补的内部引物，其包括第三核酸序列和第四核酸序列，所述第三核酸序列被构造成与所述第一扩增产物的第一反义链杂交以产生第二扩增产物的第二有义链，且所述第四核酸序列被构造成与所述第一扩增产物的第一有义链杂交以产生所述第二扩增产物的第二反义链；和如下产生全长靶核酸：使所述第一有义链的第一个3’末端区域与所述第一反义链的第二个3’末端区域退火，其中所述第一有义链的第一个3’末端区域引发所述第一有义链在所述第一反义链上面的延伸，且所述第一反义链的第二个3’末端区域引发所述第一反义链在所述第一有义链上面的延伸；和使所述第二有义链的第三个3’末端区域与所述第二反义链的第四个3’末端区域退火，其中所述第二有义链的第三个3’末端区域引发所述第二有义链在所述第二反义链上面的延伸，且所述第二反义链的第四个3’末端区域引发所述第二反义链在所述第二有义链上面的延伸。在某些实施方案中，所述方法还包括执行杂交步骤，该杂交步骤包括使所述全长扩增产物与一种或多种可检测探针接触和检测所述全长扩增产物的存在或不存在，其中所述全长扩增产物的存在指示所述靶核酸在所述样品中的存在，且其中所述全长扩增产物的不存在指示所述靶核酸在所述样品中的不存在。在某些实施方案中，所述杂交步骤包括使所述全长扩增产物与包含第五核酸序列的可检测探针接触，所述第五核酸序列用供体荧光部分和对应的受体部分标记，且所述检测步骤包括检测所述探针的供体荧光部分和受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述靶核酸在所述样品中的存在或不存在。在某些实施方案中，所述扩增步骤采用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在某些实施方案中，所述供体荧光部分和对应的受体部分是在所述探针上彼此的不超过8个核苷酸内。在某些实施方案中，所述受体部分是猝灭剂。在某些实施方案中，所述杂交步骤包括使所述全长扩增产物与可检测探针接触，所述可检测探针包含含有双链DNA结合染料的分子探针，所述双链DNA结合染料在与所述全长扩增产物的双链核酸相互作用后发射荧光信号，且所述检测步骤包括通过解链曲线分析来检测荧光共振的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示所述靶核酸在所述样品中的存在或不存在。在某些实施方案中，自互补的内部引物对的相对浓度等于或低于外部引物对的浓度。在某些实施方案中，所述方法还包括第二对自互补的内部引物。在某些实施方案中，所述方法还包括至少第二对自互补的内部引物(例如第二、第三、第四对自互补的内部引物)。