[发明专利]核酸的外泌体包装

说明书

提供了一种用于制备包装有目标核酸的外泌体或外泌体‑样囊泡的方法。在某些实施例中，所述方法可包括：引入包含掺入前‑miR‑451结构模拟物中的目标核酸序列的核酸构建体至外泌体‑产生细胞中，和使细胞产生外泌体。还提供了核酸构建体、组合物及其用途。

技术领域

本发明一般涉及外泌体包装。更特别地，本发明涉及用于产生富集有目标核酸的外泌体的方法和核酸构建体。

背景技术

2006年，诺贝尔医学奖授予RNA干扰(RNAi)的发现。早期的研究显示，RNAi触发剂诸如小干扰RNA(siRNA)可以容易地被设计为以特异性且有效的方式几乎沉默任何基因。这表明基因沉默核酸诸如siRNA可用于治疗各种疾病。发现反义寡核苷酸(AON)和RNA干扰(RNAi)基因沉默途径为研究人员提供了用于沉默目标基因表达的工具。这些途径都是通过将小核酸分子引入细胞中而触发的。这些小核酸分子通常被设计为与从一个或多个目标基因转录的mRNA至少部分互补，并且小核酸分子(即基因沉默核酸)识别/结合mRNA通常通过空间阻断/防止翻译或者酶促降解或裂解mRNA来触发mRNA降解。

通常，RNA干扰是一种长度约21个核苷酸的双链RNA分子可以强效沉默或阻遏具有互补mRNA序列的特定基因的表达的机制。从植物到蠕虫以及人类的生物体都有内源性RNA沉默系统，其中Argonaute(AGO)蛋白结合小RNA以沉默基因表达。在人类中，通过裂解和降解与基因沉默核酸(即siRNA引导链)完全互补的RNA，或阻遏不完全互补的mRNA的翻译(诸如在miRNA基因沉默核酸的情况下)，降低基因表达。在人类中，小RNA基因沉默子的主要类别被称为微RNA(miRNA)，其通过阻遏具有部分互补的结合位点的mRNA翻译来调控大型基因网络(Fabian,2010,Annu Rev Biochem,79:351)。miRNA是发育、肿瘤发生和神经变性疾病的必要调控剂(Pencheva,2013,Nat Cell Biol,15:546；Croce,2009,Nat Rev Genet,10:704；Abe,2013,Trends Cell Biol,23:30)。miRNA的这些关键作用已经促使一些公司开发抑制或替代miRNA的RNA-基药物。例如，针对丙型肝炎的II期临床试验中的基于miRNA治疗剂显示出显著的临床受益。正在开发用于癌症、心脏病和炎性病症(如炎性肠病和关节炎)等的其它miRNA治疗剂。

完全互补的siRNA引发靶RNA的酶促裂解和降解，从而引发明显、快速且特异性的单基因沉默。这些完全互补的小RNA通常被称为siRNA或RNAi，在研究中经常用于研究特定基因的功能，并正在开发用于患者的治疗性治疗。例如，在临床前研究中，单剂量的siRNA可以在六周内消除肝脏中80％的基因表达，仅具有最小的脱靶效应(Coelho,2013,N Engl JMed,369:819；Kanasty,2013,Nature Materials,12:967)。用单一siRNA几乎完全消除特定基因的表达的能力或用siRNA汇集物几乎完全消除一个选定组的基因的表达的能力对许多疾病具有巨大的治疗潜力，所述疾病从由引起病状的病毒或遗传突变蛋白质引起的那些疾病开始，诸如在亨廷顿氏病(Huntington’s disease)和癌症中。病毒RNA或细胞RNA在产生致病蛋白之前的近乎消除可能代表了针对这些疾病的强有利的治疗策略。RNAi也可用于通过调节(tailoring)细胞响应或增强对给定途径或生理过程的组合效应来增加现有药物的功效。

RNA沉默的强大潜力导致快速开发出几个大型RNAi治疗方案。然而，这些治疗剂的药物输送已经提出了重大挑战(Kanasty,2013,Nature Materials,12:967；Whitehead,2009,Nat Rev Drug Discov,8:129)。现在输送至肝脏在临床上似乎是强健的。靶向肝脏的miRNA和RNAi/siRNA治疗剂处于几个II期临床试验中。然而，向其它器官和细胞类型递送的挑战已经减缓了其它有前景的小RNA治疗法用于其他器官和细胞类型的癌症、心脏病、炎性和神经变性疾病的进展(Kanasty,2013,Nature Materials,12:967；Whitehead,2009,NatRev Drug Discov,8:129)。