[发明专利]靶核酸的等温环介导扩增(LAMP)的荧光检测的方法，寡核苷酸及其试剂盒

说明书

本发明涉及基于荧光共振能量转移(FRET)机制的用于检测靶核酸序列的等温环介导(LAMP)扩增的方法。本发明还涉及适用于实施本发明的LAMP‑FRET方法的寡核苷酸的组和试剂盒。

技术领域

本发明涉及通过环介导等温扩增(LAMP)检测核酸扩增的方法，以及用于进行本发明方法的一组寡核苷酸和试剂盒。

背景技术

环介导等温扩增(LAMP)是最近开发的经由自动循环链置换反应的核酸扩增方法，其通常在60℃至65℃的恒定温度下进行(Notomi T.et al2000.Nucleic acidsRes.Vol.28(12)-e63)。这种技术采用具有链置换活性的DNA聚合酶和一组四个寡核苷酸，称为内部和外部引物，其专门设计为识别靶核酸上的六个不同的识别位点。两个外部引物仅在非循环步骤期间在链置换中发挥作用，而内部引物同时包括正义和反义序列并帮助形成具有茎环结构的典型LAMP扩增产物。

除了四种寡核苷酸引物之外，LAMP测定还可以涉及使用两种另外的引物，即所谓的环引物，以提高扩增效率，由此得到每个靶序列共六个引物。跨越靶核酸上的八个不同序列的不同引物的这种组合提供了显著程度的测定特异性。

基于LAMP的技术具有灵敏度高，扩增快和操作简单的优点。LAMP测定导致扩增产物的高效合成，其比相同体积中通过经典PCR反应获得的高至少50倍。另外，在等温条件下扩增核酸的能力使得能够使用简单且有成本效益的设备，而不需要热循环。在LAMP测定中，特异性扩增子的扩增和检测可以在一个步骤中完成，从而与标准RT-PCR相比显著减少了反应时间。

已经采用了几种方法检测LAMP扩增产物，包括沉淀的焦磷酸镁的目测或浊度监测(Tomita N.,et al.2008.Nat.Protoc.3:877-882；Mori Y.,etal.2001.Biochem.Biophys.Res.Commun.289:150-154)，采用插入荧光团的双链DNA(dsDNA)的荧光检测(Zhang X,et al.2013,PLoS One8(12):e82841；Mair G.et al.2013,BMC Veterinary Research 9:108.)，通过焦磷酸盐转化报道的生物发光(Gandelman OA.,et al.2010,PLoS One 5(11):e14155)。

用于间接检测LAMP扩增的已知策略主要依赖于作为反应副产物的焦磷酸盐的形成。随着LAMP反应进行，焦磷酸根离子通过在核酸聚合期间脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)引入DNA链中而释放，而这些离子与存在于反应混合物中的二价金属离子，特别是镁离子反应而产生白色不溶性焦磷酸镁沉淀(Mori Y.,et al.2001.Biochem.Biophys.Res.Commun.289:150-154)。这种产物导致反应溶液的浊度逐渐增加，并且焦磷酸盐沉淀物可以在浊度方面定量测量，或通过离心后通过肉眼观察为颗粒。在可选的方式中，LAMP扩增的检测通过在反应中引入锰离子和钙黄绿素实现。钙黄绿素的荧光通过结合锰离子而自然淬灭。作为LAMP反应的副产物的焦磷酸盐生成通过沉淀从缓冲液中去除锰离子，而与恢复的钙黄绿素荧光相关联的浊度增加使得能够在用可见光或UV光激发时容易地目视读取(Tomita N.,etal.2008.Nat.Protoc.3:877-882)。在又一种检测方式中，通过由热稳定的萤火虫荧光素酶产生的生物发光监测在DNA合成期间产生的焦磷酸向ATP中的酶促转化(Gandelman OA.,etal.2010,PLoS One5(11):e14155)。