[发明专利]视网膜色素上皮细胞的制备

权利要求书

1.一种产生视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，其包括：

(a)在包含分化剂的培养基中的粘附表面上培养未分化的人多能干细胞的细胞群体以获得分化细胞，其中所述细胞群体的至少50％的细胞是Oct4⁺TRA-1-60⁺；和

(b)在包含TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基中的所述粘附表面上培养所述分化细胞以获得RPE细胞。

2.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(a)之前，在所述分化剂不存在的情况下在所述粘附表面上扩增所述未分化的人多能干细胞群体。

3.权利要求2的方法，其中所述扩增在所述分化剂不存在的情况下进行。

4.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(b)后，从所述粘附表面分离所述RPE细胞。

5.权利要求4的方法，进一步包括在所述分离后在另外的粘附表面上培养所述RPE细胞，以产生扩增的RPE细胞群体。

6.权利要求5的方法，进一步包括收获所述RPE细胞。

7.权利要求4的方法，其中所述分离是通过酶促实现的。

8.权利要求1的方法，进一步包括在步骤(a)之前，在人饲养细胞上扩增所述人多能干细胞。

9.权利要求2的方法，进一步包括在所述粘附表面上的所述扩增之前，在人饲养细胞上扩增所述人多能干细胞。

10.权利要求5的方法，其中所述扩增的RPE细胞群体的超过90％的细胞是CRALBP⁺PMEL17⁺。

11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述粘附表面选自层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白IV。

12.权利要求11的方法，其中所述粘附表面是层粘连蛋白或玻连蛋白。

13.权利要求12的方法，其中所述层粘连蛋白是层粘连蛋白521。

14.权利要求5的方法，其中所述另外的粘附表面选自明胶、聚-d-赖氨酸、层粘连蛋白、胶原蛋白I和胶原蛋白IV。

15.权利要求14的方法，其中所述另外的粘附表面是明胶或聚-d-赖氨酸。

16.权利要求1的方法，进行至少3周。

17.权利要求6的方法，进一步包括在所述收获后将所述RPE细胞冷冻保存。

18.权利要求17的方法，其中所述冷冻保存在选自90％HS/10％DMSO、CryoStor 2％、CryoStor 5％和CryoStor 10％，以及Stem Cell Banker的介质中进行。

19.权利要求9的方法，其中所述人饲养细胞包括人脐带成纤维细胞。

20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞。

21.权利要求1-19任一项的方法，其中所述分化剂包括烟酰胺。

22.权利要求21的方法，其中所述步骤(a)的培养基不含激活素A。