[发明专利]大型基因组DNA敲入及其用途

权利要求书

1.一种在哺乳动物的细胞的基因组中通过同源重组插入大型外源基因组DNA以替换内源基因组DNA的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供细菌人工染色体(BAC)；

(b)提供约10-300kb的大型外源基因组DNA；

(c)向所述BAC中插入所述大型外源基因组DNA，

其中所述大型外源基因组DNA的侧翼为约10-30kb的近端区域和约10-30kb的远端区域，和

其中所述近端区域和所述远端区域在所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA的侧翼；

(d)制备第一对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第一对包含第一gRNA和第二gRNA，其中所述第一gRNA和所述第二gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离近端接合点约250bp内的第一Cas9切割位点和第二Cas9切割位点，其中所述近端区域在所述近端接合点处连接所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA；

(e)制备第二对CRISPR/Cas9指导RNA(gRNA)，所述第二对包含第三gRNA和第四gRNA，其中所述第三gRNA和所述第四gRNA分别靶向所述内源基因组DNA中距离远端接合点约250bp内的第三Cas9切割位点和第四Cas9切割位点，其中所述远端区域在所述远端接合点处连接所述细胞的所述基因组中的所述内源基因组DNA；

(f)提供Cas9蛋白质或能够产生所述Cas9蛋白质的Cas9编码序列；和

(g)向所述哺乳动物的所述细胞中导入：

(i)步骤(c)中的所述BAC；

(ii)步骤(d)中的所述第一对CRISPR/Cas9指导RNA；

(iii)步骤(e)中的所述第二对CRISPR/Cas9指导RNA；和

(iv)步骤(f)中的所述Cas9蛋白质或Cas9编码序列；

由此：

(i)所述第一对gRNA引导所述Cas9蛋白质切割所述内源基因组DNA中在所述近端接合点处的所述第一和所述第二Cas9切割位点以产生第一双链断裂(DSB)；

(ii)所述第二对gRNA引导所述Cas9蛋白质切割所述内源基因组DNA中在所述远端接合点处的所述第三和所述第四Cas9切割位点以产生第二DSB；和

(iii)所述大型外源基因组DNA在所述第一DSB和所述第二DSB处通过同源重组整合到所述细胞的所述基因组中以替换所述近端区域和所述远端区域之间的所述内源基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约15-200kb。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约20-100kb。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述大型外源基因组DNA为约25kb。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为合子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(g)通过显微注射进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述显微注射使用约1-10ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述显微注射使用约2-8ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述显微注射使用约5ng/μL含有所述大型外源基因组DNA的所述BAC进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为胚胎干细胞(ES细胞)。

11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(g)通过电穿孔进行。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述BAC不携带选择标志物。