[发明专利]大型基因组DNA敲入及其用途

说明书

本发明提供了用于利用大容量克隆载体(例如，BAC)以携带侧翼为近端和远端区域(10kb)的大型外源基因组DNA(约10‑300kb)以在CRISPR/Cas9刺激的同源重组中有效插入到细胞的基因组中的组合物和方法。还提供了用于向小鼠合子中显微注射大型人类基因以制备基因修饰小鼠的方法和组合物。

相关申请的引用

本申请依据35 U.S.C.§119(e)要求于2015年11月6日提交的美国临时申请号62/252,080的优先权益，该临时申请的整个内容通过引用以其全文并入本文。

政府支持

本发明在美国国立卫生研究院(NIH)的美国国家癌症研究所(NCI)授予的批准号P30CA034196的美国政府支持下完成。美国政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

基因组编辑是其中插入、替换或从基因组移除DNA的基因工程类型。近年来，已使用人工工程化的核酸酶(也称为“分子剪刀”)实现基因组编辑。所述核酸酶在基因组中的期望位置处产生双链断裂(DSB)，并利用细胞的内源性机制以通过同源定向修复(HDR，其一种常见形式是同源重组(HR))和非同源末端连接(NHEJ)的自然过程修复所诱导的断裂。

常使用限制性核酸内切酶(RE)在靶DNA中产生DSB。由于识别序列短(通常为4-8bp)，RE在大的基因组DNA区域中产生太多的DSB。为克服此问题，若干不同类型的核酸酶已被生物工程化以产生更适合大基因组区域的位点特异性DSB；例如，锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统和工程化兆核酸酶。

兆核酸酶通常见于一些微生物物种中。它们具有识别序列非常长(＞14bp)的独特性质，因此使得它们是天然特异性的，并适于在大型基因组中的基因组编辑过程中产生位点特异性DSB。然而，该方法的限制在于已知的兆核酸酶很少，因此严重限制了该方法可覆盖的靶序列。已使用诱变和高通量筛选方法来产生识别独特序列的兆核酸酶变体。已融合各种兆核酸酶来产生具有新的识别序列的杂交酶。其他人已试图通过改变兆核酸酶的DNA-相互作用残基来合理设计兆核酸酶，以设计序列特异性兆核酸酶(参见例如美国专利号8,021,867)。

基因组编辑中的其他传统基因工程化技术包括随机转基因、靶向转基因和重组酶介导的盒式交换(RMCE)。这些方法中的每一种都有其缺点。例如，随机转基因方法偏离同源内源性基因座处的基因组修饰，足以允许转基因随机整合(此时它们发生多样化表达)。在靶向转基因术过程中，转基因可被明确引导至标准化安全港位点以限制这种位置效应多样化，但即便在这里，转基因也与其内源性同源基因没有联系。类似于相关RMCE方法，靶向转基因术可涉及侧翼为重组酶结合位点的抗生素选择盒的使用。除了增加的复杂性外，删除这些选择盒需要繁殖到特定的重组酶表达小鼠，从而延长品系发育。

对于过去三十年来在小鼠中使用的类别的传统基因靶向，基于大量文献的传统范式是创建具有几个至几千个碱基对长度的两个同源臂的质粒载体充当供体分子。这些臂位于质粒内以便侧接研究者改变的序列，其将在向胚胎干细胞(ES细胞)和HDR中导入质粒载体后整合到基因组中。常常采用阳性和阴性选择盒来帮助选择含有适当整合的序列的罕见胚胎干细胞(ES细胞)克隆。该技术足以在从一个核苷酸到数千个碱基对的规模上修改基因组序列。然而，在尝试改变常达到数万或数十万个碱基对的整个小鼠基因时，此方法可能不符合标准。