[发明专利]微生物的识别方法

说明书

提供一种选定并使用标记蛋白质的微生物的识别方法，该标记蛋白质对李斯特菌属的菌种的再现性良好，并能够迅速地识别李斯特菌属的菌种。本发明的微生物的识别方法，其特征在于，具有：对含有微生物的试样进行质量分析从而得到质谱的步骤；读取步骤，从所述质谱读取源自标记蛋白质的峰的质荷比m/z；识别步骤，基于所述质荷比m/z对所述试样所含的微生物含有李斯特菌的哪一个菌种进行识别，使用17种核糖体蛋白质L3、L4、L23、L2、L24、L6、L18、S5、L15、S13、S11、L10、L21、L13、S9、L31以及S16中的至少一种作为所述标记蛋白质，特别是使用所述17种中的8种核糖体蛋白质L24、L6、L18、L15、S11、S9、L31以及S16的至少一种作为所述标记蛋白质。

技术领域

本发明涉及利用了质量分析的微生物的识别方法。

背景技术

以往作为识别微生物的种类的方法之一，公知有基于DNA碱基序列的同源性分析，并被广泛地用于微生物的分类、鉴定(例如参照专利文献1)。在该方法中，首先从被检微生物中提取DNA并确定rRNA基因等在所有生物中以较高保存性存在的区域的DNA碱基序列。然后，使用该DNA碱基序列，对大量收录了已知微生物的DNA碱基序列的数据库进行检索，选出显示出与所述被检微生物的DNA碱基序列相似性较高的碱基序列。接下来，将该碱基序列所源自的物种判断为与所述被检微生物为相同物种或者近缘物种。

然而，在这样的利用了DNA碱基序列的方法中，由于从被检微生物中提取DNA以及确定碱基序列等需要较长的时间，所以存在难以迅速地进行微生物鉴定的问题。

于是近年来，基于对被检微生物进行质量分析从而得到的质谱图进行微生物鉴定的方法逐渐被使用。根据质量分析，由于能够使用极微量的微生物试样而在短时间内得到分析结果，并且也容易对多个被检体进行连续分析，所以能够简便且迅速地进行微生物鉴定。在该方法中，首先通过使用了MALDI-MS(基质辅助激光解吸离子化质量分析)等的软离子化法的质量分析装置，对包含从被检微生物提取的蛋白质的溶液或被检微生物的悬浮液等进行分析。另外“软”离子化法是指难以产生高分子量化合物的分解的离子化法。然后，通过将得到的质谱图与大量预先收录于数据库的已知微生物的质谱图进行对照，从而进行被检微生物的鉴定。由于这样的方法利用质谱图作为各微生物的特异的信息(即指纹)，所以被称为指纹图谱法。

然而，在根据使用了上述的质量分析的指纹法进行微生物的鉴定中，即便能够进行在属等级或者较远缘的种等级中的鉴定，但是一般难以进行近缘种间的识别或者比种更下位的分类等级即亚种、病原型、或者株等的等级中的识别。进而，在指纹图谱法中，出现在质谱上的各峰的每一个源自哪种蛋白质未被确定，从而在鉴定的理论依据以及可靠性方面存在技术问题。因此，为了解除该技术问题，开发出了如下的方法：利用大约一半的、对微生物菌体进行质量分析得到的峰的是源自核糖体蛋白质这一点，并将通过质量分析得到的峰的质荷比，与根据翻译了核糖体蛋白质基因的碱基序列信息的氨基酸序列而推测出的计算质量相关联，由此对作为该峰的来源的蛋白质种类进行归属(参照专利文献2、3)。根据该方法，使用质量分析而能够进行基于理论依据的可靠性高的微生物鉴定。

但是，由于根据微生物的分类等级(科、属、种、亚种、病原型、血清型、株等)的质量的不同，从而出现的峰不同，例如，为了再现性良好地进行病原型或株等级中的识别，需要选择能够用于作为鉴定对象的病原型或株等级中的识别的标记峰。例如作为对恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)以及它的类缘细胞进行鉴定、识别时的标记蛋白质，据报告能够利用23种的核糖体亚基蛋白质(L5、L13、L14、L15、L18、L19、L20、L22、L23、L24、L28、L30、L35、L36、S7、S8、S10、S13、S14、S17、S19、S20以及S21)(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006-191922号公报

专利文献2：日本特开2007-316063号公报