[发明专利]单细胞测序文库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种构建单细胞测序文库的方法，其包括如下步骤：

a）裂解单细胞，获得单细胞裂解物；

b) 对步骤a）所得单细胞裂解物进行细胞核与细胞质的分离，获得细胞核溶液与总RNA溶液；

c）对步骤b）所得细胞核溶液进行染色质DNA文库构建，获得所述单细胞的染色质可接近性测序文库；并且，对步骤b）所得总RNA溶液进行转录组文库构建，获得所述单细胞的转录组测序文库；

步骤c）中，利用Tn5转座酶进行染色质DNA文库构建，包括：

c1) 利用 Tn5转座酶切割染色质开放区域，其包括利用Tn5转座酶对染色质DNA进行片段化以及在片段化后进行片段化终止的步骤；

在步骤c1）后，对所得产物进行第二次裂解；以及

c2）对经片段化的染色质DNA进行扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行第二次裂解的同时，向体系中加入载体DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c2）之前，对第二次裂解产物进行纯化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Tn5转座酶进行染色质DNA文库构建还包括：

对步骤c2）的扩增产物进行第二次扩增。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用RLT Plus buffer进行第二次裂解。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体DNA的加入量为4-6 ng/μl体系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体DNA的加入量为5 ng/μl体系。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在染色质DNA文库构建完成后，对所构建的染色质DNA文库进行扩增。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c1）中，用于使染色质DNA片段化的单个片段化体系包括：

细胞核溶液；5×片段化缓冲液，0.2 μl/μl反应体系；TTE Mix V5S，0.03-0.05 μl/μl反应体系；Tris-HCl，pH7.5，8-12 mM；NaCl，8-12mM；其余为水；

在片段化后，向单个片段化体系中加入以下组分进行片段化终止：EDTA，pH8.0，50-70mM；Tris-HCl，pH8.0，10-14 mM；其余为水。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤c1）中，用于使染色质DNA片段化的单个片段化体系包括：

细胞核溶液；5×片段化缓冲液，0.2 μl/μl反应体系；TTE Mix V5S，0.04 μl/μl反应体系；Tris-HCl，pH7.5，10 mM；NaCl，10 mM；其余为水；

在片段化后，向单个片段化体系中加入以下组分进行片段化终止：EDTA，pH8.0，60 mM；Tris-HCl，pH8.0，12 mM；其余为水。

11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤c2）的扩增采用由核苷酸序列5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′和核苷酸序列5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′组成的引物对。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，第二次扩增采用由核苷酸序列5'-phos-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTTCGTCGGCAGCGTC-3'和核苷酸序列5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTC-条形码序列-GTCTCGTGGGCTCGG-3'组成的引物对。