[发明专利]单细胞测序文库的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种构建单细胞测序文库的方法，包括如下步骤:a)裂解单细胞，获得单细胞裂解物；b)对步骤a)所得单细胞裂解物进行细胞核与细胞质的分离，获得细胞核溶液与总RNA溶液；c)对步骤b)所得细胞核溶液进行染色质DNA文库构建，获得所述单细胞的染色质可接近性测序文库；并且，对步骤b)所得总RNA溶液进行转录组文库构建，获得所述单细胞的转录组测序文库。

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体地，本发明涉及一种构建单细胞测序文库的方法，基于单细胞多组学(Single Cell Multi-Omics Sequencing,SCMOS)的测序方法及应用。

背景技术

单细胞测序技术是近几年最受关注的测序技术之一，目前已经发表的单细胞测序技术主要包括单细胞DNA和DNA甲基化测序，单细胞RNA测序，单细胞染色质可接近性(Chromatin accessibility)测序。

例如，Fuchou Tang等人(Nature Methods 6,377-382(2009))报道了单细胞RNA测序技术，其包括：通过强裂解液对单细胞进行充分裂解，然后对其中尾部带有多聚腺嘌呤的RNA进行反转录和PCR扩增，最后基于特定的测序平台进行建库和测序。

再例如，Buenrostro等人(Nature 523,486–490(2015))报道了单细胞染色质可接近性测序技术，其包括：利用微流控芯片技术，将针对5万细胞的微升级的反应体系等比例缩减至单个细胞的纳升级的反应体系；通过对单细胞进行裂解和Tn5转座酶处理，在染色质中开放区域插入测序接头，然后通过PCR扩增的方法进行全部开放染色质区域的扩增，并进行建库和测序。

除了单个组学水平上的测序之外，如何在单个细胞中充分捕获单细胞多个组学的信息是当前的难题。单细胞多组学测序过程面临的主要问题是单个细胞中的目标物质(如DNA，RNA，染色质)总量非常少，在不同维度的操作过程中非常容易带来损失，直接导致多组学建库的失败或者出现检测灵敏度不高、组学信息丢失严重、技术噪音高、操作失误率高、重复性差等问题。

目前，已经实现了在单细胞DNA或DNA甲基化与单细胞RNA之间的整合性测序，例如，Macaulay等人(Nature Methods 12,519–522(2015))报道了一种单细胞DNA与RNA同时测序的方法，其包括：用强裂解液进行裂解，然后利用磁珠捕获带有polyA的mRNA，分离完之后，再对剩余液体中的DNA进行全基因组扩增，进一步进行全基因组DNA建库，RNA进行cDNA建库。与此类似的是，Angermueller等人(Nature Methods 13,229–232(2016))基于此开发了单细胞DNA甲基化和RNA同时测序的方法，与前一种方法不同的地方在于DNA和RNA分离后，对剩余液体中的DNA进行重亚硫酸盐处理，然后对处理后的DNA进行建库。再例如，Hou等人(Cell Research 26:304–319(2016))报道了另一种单细胞DNA甲基化与RNA同时测序的方法，其包括：首先利用弱裂解液裂开细胞膜，释放细胞质，但保留细胞核。然后分离细胞质进行RNA建库，对细胞核进行重亚硫酸亚处理，进一步进行DNA建库。

然而，对于单细胞的其他不同组学之间的整合，例如单细胞RNA和染色质可接近性同时测序，目前还无任何相关报道。

现有技术中，由于单细胞的基于转座酶的染色质可接近性测序分析(assay fortransposase-accessible chromatin，ATAC-seq)，其反应体系都是在微流控芯片的纳升级反应体系中进行，这不利于有效分离染色质和RNA，因此也无法在单细胞中进行染色质可接近性和转录组的同时建库。

发明内容