[发明专利]一种CRISPR文库筛选的方法

权利要求书

1.一种全基因组文库，包括：

多个PB介导的CRISPR系统多核苷酸，包含向导RNA，除人U6启动子外没有任何筛选标记和相关的启动子，

所述CRISPR系统多核苷酸包含：

(i)编码Cas9蛋白或其变体或其融合蛋白的第一多核苷酸，

(ii)编码PB转座酶或其变体或其融合蛋白的第二多核苷酸，

(iii)向导RNA的第三多核苷酸，

其中(i),(ii),和(iii)组分位于相同或不同载体，所述载体为PB载体；所述向导RNA的侧翼为最小的piggyBac反向重复元件，向导RNA由人U6启动子驱动；

并且所述向导RNA能够靶向真核细胞群、组织群或有机体群中的多个基因座中的多个目标靶序列。

2.如权利要求1中所述文库，其中所述真核细胞群是哺乳动物细胞群。

3.如权利要求2中所述文库，其中所述真核细胞群是小鼠细胞或人类细胞。

4.如权利要求1中所述文库，其中所述真核细胞群是任何种类的细胞群。

5.如权利要求4中所述文库，其中所述真核细胞群是成纤维细胞。

6.如权利要求1中所述文库，其中所述组织群是任何种类的非生殖组织群。

7.如权利要求6中所述文库，其中所述组织群是肝脏或肺。

8.如权利要求1中所述文库，其中有机体群所述有机体群是小鼠群。

9.如权利要求1中所述文库，其中基因组基因座中的靶序列是编码序列。

10.如权利要求1中所述文库，其中所述靶序列的基因功能被所述靶向改变。

11.如权利要求1中所述文库，其中所述靶向可导致基因功能的敲除。

12.如权利要求1中所述文库，其中所述靶向是靶向整个基因组。

13.如权利要求11中所述文库，其中基因功能的敲除是在多个独特的基因中实现的，所述基因在肿瘤发生、抗衰老和寿命中起着介导作用。

14.如权利要求13中所述文库，其中所述独特基因是抑癌基因。

15.一种体内基因组的规模筛选方法，包括：

(a)将载体导入包含并表达具有靶序列的RNA多核苷酸的哺乳动物中，

(b)编码含有至少一种PB介导的一种或多种载体的CRISPR系统基因产物，其中

所述载体包含:

(i)编码Cas9蛋白或其变体或其融合蛋白的第一多核苷酸，

(ii)编码PB转座酶或其变体或其融合蛋白的第二多核苷酸，

(iii)如权利要求1-14所述文库的向导RNA的第三多核苷酸，

其中(i),(ii),和(iii)组分位于系统中的相同或不同载体，所述载体为PB载体；所述向导RNA的侧翼为最小的piggyBac反向重复元件，向导RNA由人U6启动子驱动；

PB转座酶由此将向导RNA引入基因组，向导RNA靶向靶序列，Cas9蛋白通过细胞修复机制修复产生至少一个位点特异性断裂，

(c)对所述哺乳动物的基因组DNA进行扩增和测序。

16.如权利要求15中所述方法，其中所述基因产物的基因功能由所述系统改变。

17.如权利要求15中所述方法，其中所述系统导致基因功能的敲除。