[发明专利]一种CRISPR文库筛选的方法

说明书

提供了包含多个PB介导的CRISPR系统多核苷酸的基因组文库，其包含侧翼为最小的piggybac反向重复元件的最小向导RNA。还提供了使用所述多核苷酸文库进行体内基因组规模筛选的方法。

技术领域

本发明关于用于诱变的载体构建、全基因组筛选技术，尤其关于作为递送向导RNA文库载体的piggyBac(PB)转座子，并且设计用于体内筛选。

背景技术

在过去的十年中，转座子诱变和RNA干扰介导的筛选一直是小鼠体内肿瘤基因筛选和验证的主要方法(Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics 46(1)：24-32.(2014)；Carlson CM，et al.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 102(47)：17059-17064.(2005)；Keng VW，et al.Naturebiotechnology 27(3)：264-274.(2009)；Dupuy AJ，et al.Nature 436(7048)：221-226.(2005)；Zender L，et al.Cell 135(5)：852-864.(2008)；Schramek D，et al.Science 343(6168)：309-313.(2014))。然而，由于效率低，这两种方法尚未得到广泛应用。近年来，CRISPR/Cas9已成为一种高效的诱变工具(Cong L，et al.Science 339(6121)：819-823.(2013)；Mali P，et al.Science 339(6121)：823-826.(2013))并被迅速应用为体内肿瘤诱导和肿瘤基因验证的一种技术(Sanchez-Rivera FJ，et al.Nature 516(7531)：428-+.(2014)；Chiou SH，et al.GenesDevelopment 29(14)：1576-1585.(2015)；Zuckermann M，et al.Nature Communications 6：9.(2015)；Maddalo D，et al.Nature 516(7531)：423-+.(2014)；Xue W，et al.Nature 514(7522)：380-384.(2014)；Weber J，etal.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 112(45)：13982-13987.(2015))。通过将CRISPR文库转导的癌细胞移植到免疫缺陷的小鼠体内，已鉴定了多种与人类肺癌生长和转移有关的基因(Chen SD，et al.Cell160(6)：1246-1260.(2015))。然而，由于目前慢病毒递送方法的局限性，目前还没有成功地实现全基因组CRISPR的直接体内筛选(Chen SD，et al.Cell 160(6)：1246-1260.(2015)；Sanchez-Rivera FJ，et al.Nature 516(7531)：428-+.(2014))。此外，所有以前的筛选策略都有多个缺点。这些筛选通常从免疫缺陷的遗传背景或携带多个预先设计的突变的遗传背景开始，因此结果可能不适用于野生型小鼠(Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics46(1)：24-32.(2014)；Zender L，et al.Cell 135(5)：852-864.(2008))。他们通常需要1年以上才能获得肿瘤(Weber J，et al.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 112(45)：13982-13987.(2015)；Bard-Chapeau EA，et al.Nature genetics 46(1)：24-32.(2014)；Keng VW，et al.Naturebiotechnology 27(3)：264-274.(2009))。