[发明专利]一种新型呼吸道合胞体病毒pre-F融合蛋白载体的制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种新型呼吸道合胞体病毒pre‑F融合蛋白载体的制备方法和应用。所述的RSV pre‑F融合蛋白载体由如下方法制备得到：将第三个半胱氨酸(第182位)突变为丝氨酸的G蛋白CX3C类似域的天然颈环loop结构域连接到pre‑F的铰链区。所述的RSV pre‑F融合蛋白保持了RSV pre‑F的位点的构象，保证了其高免疫原性，能够诱导高水平的pre‑F的中和抗体，减少RSV病毒对机体免疫的操控，从而减轻免疫造成的损伤。本发明所描述的RSVpre‑F融合蛋白可潜在地应用于：抗人RSV疫苗研发；抗人RSV感染的中和抗体和药物筛选；作为基因载体应用于其它病原体疫苗的研发。

技术领域

本项发明属于生物技术领域，该发明涉及一种新型呼吸道合胞体病毒pre-F融合蛋白载体的制备方法和应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)属于副黏病毒科，肺炎病毒属，病毒粒子直径为150～300nm，为负链RNA病毒。在RSV外膜具有G、F、SH等跨膜糖蛋白，其中RSV F和RSV G两种糖蛋白，是激发机体产生保护性抗体的最主要的病毒抗原，是呼吸道合胞病毒疫苗研究开发的重要内容。目前临床上使用的RSV治疗性帕丽珠抗体的目标蛋白也是RSV F蛋白。

RSV F蛋白同流感的HA和HIV-1的env蛋白一样，都是I型融合糖蛋白。病毒在细胞内首先表达前体蛋白F0(pre-F)，然后进行酶切后形成三个聚合的多肽p27、F2和F1，经过结构重排F2和F1形成一个稳定的成熟结构(post-F)才能被激活病毒与细胞膜融合功能。为了形成有功能的post-F构象，pre-F蛋白通过打开回折区域1(refolding region 1，RR1)、融合功能区和heptad repeat A(HRA)形成长的螺旋结构，此时位于RR1末端的融合多肽就能介导病毒和细胞膜的融合。目前在F蛋白上已经发现至少有五种中和位点，位点I，II和IV是pre-F和post-F构型上共有的位点。其中位点II是RSV治疗性抗体帕丽珠抗体治疗靶点。但pre-F比post-F具有更多的中和表位。如近两年在pre-F蛋白的顶端发现的一个特有的中和位点，被称为位点，该位点诱导产生的中和抗体有D25、AM22和5C4，它们的中和活性是帕丽珠的10-100倍，另外一个pre-F蛋白特异的中和位点能够被单抗MPE8识别，这个位点虽然被定为到中和位点II附近， 但是只存在pre-F构型中。还有一个pre-F特异性抗体AM14，只识pre-F蛋白的三聚体结构。

研究表明利用pre-F蛋白吸附人血清后，血清的中和活性减少了90％，这表明了人血清中主要的中和抗体是针对preF的特异性抗体。小鼠研究表明利用pre-F蛋白免疫后，诱导的中和抗体滴度是post-F蛋白诱导滴度的4-10倍；其低剂量的免疫的情况下，也能够起到很好的保护作用。另外利用pre-F蛋白免疫后，其免疫致病现象也低于post-F蛋白。因此，目前RSV pre-F蛋白亚单位疫苗是RSV疫苗开发的主要关注点。

RSV G蛋白是一个被膜蛋白，是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白之一，其可以诱导机体产生显著的血清中和抗体和粘膜免疫力，能有效防止RSV再感染。RSV G外膜蛋白130～230位氨基酸为保守氨基酸，在173位、176位、182位及186位有四个半胱氨酸两两形成二硫键，形成了一个颈环loop结构，其结构类似趋化因子fractalkine的CX3C结构域。在病毒感染过程中，G蛋白的CX3C相似域通过竞争性地结合免疫细胞上的fractalkine受体CX3CR1，干扰机体产生相应的细胞因子和趋化因子等正常免疫反应，起到免疫逃避的作用。因此利用CX3C保守区域制备的疫苗能够阻止G蛋白的CX3C-CX3CR1相互作用，从而避免RSV感染后操纵机体免疫和发炎反应，减少免疫致病现象，该方法是一个有效开发RSV疫苗的一个策略。